Browsing by Subject "kvantitatiivinen PCR"

Sort by: Order: Results:

Now showing items 1-3 of 3
  • Nurminen, Maarit (Helsingin yliopisto, 2019)
    Tutkimus on perinteisesti keskittynyt taloudellisesti merkittävien, jalostettujen tuotantokasvien tauteihin. Luonnonkasvien tauteja on tutkittu huomattavasti vähemmän, vaikka niillä on suuri merkitys kasviyhteisön monimuotoisuuden säätelijöinä. Etenkin virusten vaikutuksista on hyvin vähän tietoa, koska tartuntoja on hankala havaita. Virukset ovat ehdottomia solunsisäisiä loisia ja tarvitsevat vektoreita levittäytyäkseen kasvien välillä. Virusten esiintymisten ja vaikutusten on havaittu vaihtelevan runsaasti ajallisesti sekä lajien ja populaatioiden välillä. Tässä työssä selvitettiin Plantago lanceolatan latenttiviruksen (PlLV) ja Plantagon latentin caulimoviruksen (caulimovirus), esiintymistä kolmessa eri puolilla Ahvenanmaata sijaitsevassa heinäratamon (Plantago lanceolata) populaatiossa. Kustakin populaatiosta valittiin 20 satunnaista kasvia tutkimukseen. Lehdistä kerättiin näytteitä kerran viikossa kolmen viikon ajan touko-kesäkuussa 2017. Kasvien kukkien ja lehtien lukumäärä sekä pisimmän lehden pituus kirjattiin ylös. Lisäksi mahdolliset viroottiset oireet ja herbivorien aikaansaamat syömäjäljet kirjattiin ylös. Virusten havaitsemista varten kehitettiin qPCR-menetelmä aiempien virussekventointien pohjalta. Alukkeet suunniteltiin mahdollisimman konservoituneille alueille virusten perimässä. qPCR-menetelmän kynnysarvon asettamisen apuna oli lisäksi 218 kasvihuonekasvinäytettä, jotka oli testattu valmiiksi jo olemassa olevalla PCR-menetelmän alukkeilla. Luonnonkasvinäytteet tutkittiin sekä qPCR- että PCR-menetelmillä, joiden tulokset yhdistettiin. Sekä PlLV:ä että caulimovirusta esiintyi kaikilla populaatioilla, mutta esiintymisessä ei ollut merkitseviä populaatioiden välisiä eroja. PlLV-havainnot vähenivät merkitsevästi tutkimusaikana, mutta caulimoviruksen esiintyminen ei vaihdellut. Caulimovirushavainnot korreloivat positiivisesti lehtien lukumäärän sekä erään syömäjälkiluokan kanssa. Muut kasvin ominaisuudet tai herbivorien jättämät syömäjäljet eivät selittäneet virustartuntoja. Viroottiseksi tulkittuja oireita oli sekä virustartuntaisilla että terveiksi todetuilla kasveilla. Vanhat PCR-menetelmät tunnistavat jossain määrin qPCR-menetelmiä paremmin virustartunnat, mutta menetelmät tunnistavat osittain eri tartunnat. Tulokset vahvistavat aiempia havaintoja siitä, että virusten esiintyminen luonnonkasveilla on vaihtelevaa, eivätkä ne aina välttämättä aiheuta näkyviä oireita, mikä tekee niiden vaikutusten arvioinnista haastavaa. Virukset ovat täysin vektoreista riippuvaisia, ja tulos antaa mahdollisia viitteitä caulimoviruksen vektorilajista. Suurikokoiset kasvit vaikuttavat olevan alttiimpia caulimovirustartunnalle. qPCR-menetelmä täydentää PCR-menetelmää, mutta vaatii lisäoptimointia tehokkuuden parantamiseksi. Jatkotutkimukset suuremmalla otannalla ja pidempiaikaisella seurannalla valottaisivat, millaisia vaikutuksia virustartunnoilla on kasveihin missäkin olosuhteissa.
  • König, Emilia (Helsingin yliopisto, 2019)
    The percentage of silage in total dry matter consumption of cows belonging to milk recording in Finland was 51 % in 2018. Harmful microbes can be found in feed. Of these microbes’ clostridia cause problems in cheese production in dairies and yeasts affect the aerobic deterioration of silage and produce ethanol, which causes great dry matter losses. Feed microbe concentrations have traditionally been determined by cultivating, but PCR methods bring novel rapidity and sensitivity to silage microbe research. The aim of this study was to test and develop a PCR based method to detect harmful microbes in silage samples. An additional aim was to specifically identify and quantify four clostridia species and one yeast species from samples of a silage trial. First, a literature review and a database search on harmful microbes in silage were conducted. Based on the results, seven primer pairs were selected, of which three were general primer pairs and four species-specific primer pairs. The usefulness of these primers was tested on silage, cheese and yeast samples in laboratory conditions with gel electrophoresis and qPCR. Additionally, was a white lupin-spring wheat mixture ensiled without additive, with formic acid (2, 4 or 6 l/t fresh matter) and natrium nitrite (900 g/t fresh matter) -hexamine (hexamine 0, 300 or 600 g/t fresh matter) in three laboratory silos/treatment. A chemical quality analysis and quantification of harmful bacteria with qPCR were conducted on pre-ensiling forage and silage samples for Clostridium tyrobutyricum, C. butyricum, C. sporogenes, C. perfringens and Saccharomyces cerevisiae. Microbes were found in abundance. From the chosen primer pairs, two general primer pairs would have been suited for quantification on agarose gel and S. cerevisiae primers proved to be suitable for qPCR. Compared to the amount of microbe DNA, surprisingly few clostridia were found in the samples. Clostridia/spores were found only in five silos ensiled with formic acid. Butyric acid was found in more silos. Possible explanations for the small amounts of clostridia found, might be the effect of formic acid on microbe populations, minor soil contamination while mowing and collecting the forage, PCR-inhibitors in lupin, the nitrate concentration in the feed, and activity of other microbes. Yeast concentrations in the samples were high. Ethanol concentrations were small compared to yeast concentrations. There might have been too little oxygen available for the yeast. PCR-methods can be used to specify and support chemical analyses from silage. Conclusions on microbe concentrations in silage cannot be solely based on chemical analyses. Furthermore, a too specific microbe quantification might raise contradictions and problems in the interpretation of results. Primers that are genus’s specific or recognize even broader taxon might be more functional than species-specific primers.
  • Ilves, Mika (Helsingfors universitet, 2014)
    Keuhkohuuhtelunäytteiden (bronchoalveolar lavage, BAL) ottaminen koirilta ja hevosilta on yleisesti käytössä oleva diagnostinen menetelmä. Keuhkohuuhtelunäytteet soveltuvat lähinnä diffuusien keuhkomuutosten tutkimiseen. Paikallisten muutosten diagnosoimiseen menetelmä ei sovellu yhtä hyvin, eikä menetelmää voi tavallisesti käyttää bakteriologisten määritysten tekemiseen. Tavallisesti BAL-näytteen yhteydessä saatuja eukaryoottisoluja käytetään lähinnä sytologisiin määrityksiin. Huuhtelunäytteen sisältämien tulehdussolupopulaatioiden perusteella on mahdollista tehdä päätelmiä analysoitavan sairauden luonteesta ja vakavuudesta. Keuhkohuuhtelunäyteestä on perinteisesti määritetty mahdollisia patogeenimikrobeja ja -viruksia ja myöskin BAL-solujen tai BAL-huuhtelunesteen sisältämiä proteiineja tai peptidejä. Tosiaikainen kvantitatiivinen käänteiskopiointia hyödyntävä polymeraasiketjureaktio-menetelmä (RT-QPCR tai QPCR) on tehokas tapa solujen ilmentämien geenituotteiden määrän mittaamiseen. Menetelmä on yleisesti käytössä ja on syrjäyttänyt käytännössä kokonaan muut menetelmät, joita on aiemmin käytetty geenien ilmentämien tuotteiden kvantitointiin. QPCR-menetelmää on käytetty hevosten keuhkohuuhtelunäytteiden sisältämien eukaryoottisolujen geeniekspression tutkimiseen, sen sijaan julkaisuja koirien keuhkohuuhtelunäytesolujen analysointiin ei ole julkaistu. Julkaisuissa ei kuitenkaan ole yleensä tarkemmin kuvattu näytteiden ottamiseen, tutkittavan ribonukleiinihapon (RNA) eristämiseen tai muihin vaiheisiin liittyviä työvaiheita taikka vaiheisiin liittyviä ongelmakohtia. Yleisimmin tutkimuksen kohteena ovat olleet inflammaatiotapahtumassa mukana olevat geenit kuten eri interleukiinit ja kasvutekijät. Tämä kirjallisuuskatsauksen muodossa esitettävä lisensiaatintyö luo katsauksen hevosten ja koirien keuhkohuuhtelunäytteiden käsittelymenetelmiin, ja työssä esitetään aiempien julkaisujen ja Eläinlääketieteellisen tiedekunnan tutkijoiden kanssa käytyjen keskustelujen perusteella menetelmäehdotuksia keuhkohuuhtelunäytteiden ottamiseen ja niiden käsittelemiseen. Näiden ehdotusten avulla on mahdollista määrittää luotettavasti huuhtelunäytteiden sisältämien eukaryoottisolujen ilmentämien geenituotteiden määrä kvantitatiivisella PCR:llä. Suositeltavana menetelmänä on TaqMan®-kemiaan perustuva menetelmä. Näytteiden käsittelyn vaiheet kuten nukleiinihappojen eristäminen, käänteiskopiontireaktio ja itse polymeraasiketjureaktioajo pystytään suorittamaan tavanomaisilla kaupallisesti saatavilla olevilla pakkauksilla niiden valmistajien ohjeita seuraamalla. Edellä mainittujen ehdotusten mukaisesti määritettäessä keuhkohuuhtelunäytesolujen ekspressiotuotteita kvantitatiivisella polymeraasiketjureaktiolla tulee eniten huomiota kiinnittää realistiseen koejärjestelyyn sekä huolelliseen näytteenottoon ja sitä seuraavaan RNA:n eristämisvaiheeseen. Yksittäisistä vaiheista juuri RNA:n eristämisen yhteydessä tapahtuvat virheet muodostavat suurimman virhelähteen. Lisäksi huomiota tulee kiinnittää realistiseen tutkimussuunnitelmaan, käytettäviin TaqMan®-koettimiin olivat ne sitten itse suunniteltuja tai kaupallisesti hankittuja sekä saatujen tulosten merkittävyyteen.