Structural studies on lysosomal proteins

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:ISBN:978-952-10-9972-4
Title: Structural studies on lysosomal proteins
Author: Repo, Heidi
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Biological and Environmental Sciences, Department of Biosciences, Genetics
University of Helsinki, Institute of Biotechnology
Publisher: Helsingin yliopisto
Date: 2014-06-26
Language: en
URI: http://urn.fi/URN:ISBN:978-952-10-9972-4
http://hdl.handle.net/10138/135199
Thesis level: Doctoral dissertation (article-based)
Abstract: Lysosomes are membrane enclosed acidic cell organelles found ubiquitously in higher eukaryotes. The lysosomal lumen contains more than 60 soluble lysosomal hydrolases, which degrade and recycle cellular macromolecules. Mutations in genes encoding lysosomal or lysosome related proteins result in over 50 different lysosomal storage disorders (LSDs) affecting 1 out of every 7700 newborn children. For instance, the first described LSD, Pompe disease, is caused by a mutation that impairs the function of lysosomal α-glucosidase (GAA) and that results in lysosomal accumulation of glycogen. In this study, several lysosomal proteins were studied via a variety of techniques to increase the knowledge of lysosomal function and correspondingly, the lysosome associated diseases. In order to better understand its function, the previously not well characterised phospholipase B-like protein 1 (PLBD1) was purified from bovine kidneys. It was crystallised and the structure solved by X-ray crystallography to a 1.9 Å resolution. The structure showed that PLBD1 is a member of the N-terminal nucleophile aminohydrolases superfamily. This would imply that PLBD1 is not an esterase as the name suggests, but an amidase. The finding that the hydrophobic tail of the potential phospholipid substrate does not fit into the acyl binding cavity also argues against phosphoesterase function. As a first step in the protein transport pathway to lysosomes mannose-6- phosphate-tag is added to lysosomal proteins. This is initiated by N- acetylglucosamine-1-phosphotransferase (GlcNAc phosphotransferase), which requires a recognition signal on the folded surface of the lysosomal proteins. In this study, the conservation of the signal in four lysosomal proteins was analysed. The phosphorylated N-glycosylation sites and the lysine residues on the GlcNAc phosphotransferase recognition site are well conserved at the sequence level in orthologous proteins, but not necessarily in the protein family. Based on surface analysis of PLBD1 and comparison to the paralogous PLBD2, the most likely recognition site for the GlcNAc phosphotransferase for the PLBD1 could be suggested. LSD associated mutations affect protein function through several mechanism. Several disease-associated missense mutations disturb the protein fold. A general analysis of four enzymes associated with LSD showed that the disease-associated missense mutations are not equally distributed among the 20 amino acids. Glycine, arginine and proline are clearly over-represented among the mutations comparedto their abundance in protein sequences. The hydrophobic amino acids tend to be under-represented among disease-associated mutations. The amino acids where mutation frequently involves a disease have unique properties that contribute to the protein structure in a way that cannot be compensated by other amino acids. Enzyme enhancement therapy with chemical chaperones is a novel treatment for LSDs and has shown potential also for Pompe disease. In this study, the stabilisation capacity of potential chemical chaperones for GAA were tested. Most of the compounds stabilised rhGAA against thermal unfolding and some stabilised even better than would be expected from their binding affinity. In addition, the compounds were modelled to the active site of a GAA structural model and based on this three factors to be considered in chemical chaperone design were defined. Firstly, the ligand size can vary, but the four OH-groups in the ligand are critical in orienting the molecule and making the binding specific. Last but most importantly, a positive charge and its location determine the strength of binding to GAA. This thesis with its structural studies of lysosomal proteins provides molecular understanding of lysosomal protein biology, which is critical for full understanding lysosome function and its involvement in diseases.Nisäkässoluissa ja muissa eukaryoottisoluissa solun eri toiminnot ovat sijoittuneet omiin kalvojen ympäröimiin osastoihinsa eli soluelimiin. Yksi soluelimistä on lysosomi, joka on solujen pääasiallinen makromolekyylien hajotus- ja kierrätyskeskus. Hajotuksesta vastaavia lysosomaalisia entsyymejä tunnetaan tällä hetkellä yli 60 ja niiden lisäksi lysosomit sisältävät myös muita hajotuksessa avustavia proteiineja. Lysosomeja on lähes kaikissa solutyypeissä ja niiden oikea toiminta on elintärkeää soluille. Lysosomit vaikuttavat lukuisten yleisten sairauksien kuten Parkinsonin taudin synnyssä. Lysosomaaliset kertymätaudit taas ovat ryhmä vakavia perinnöllisiä sairauksia, joita tunnetaan yli 50 erilaista. Nämä harvinaiset sairaudet johtuvat mutaatioista lysosomien toimintaan liittyviä proteiineja koodaavissa geeneissä. Lysosomaaliset kertymätaudit heikentävät usein merkittävästi elämänlaatua ja johtavat varhaiseen kuolemaan. Viime vuosikymmenien edistyksestä huolimatta lysosomaalisten kertymätautien hoito on edelleen haasteellista, sillä monet saatavilla olevista hoitomuodoista kuten entsyymikorvaushoito ovat kalliita ja puutteellisesti toimivia. Aikainen diagnosointi ennen pysyvien elinvaurioiden syntymistä parantaa hoidon tehoa huomattavasti, mutta koska sairauksia ei toistaiseksi Suomessa seulota vastasyntyneiltä, ja oireet vaihtelevat eri potilailla, diagnoosi viivästyy usein vuosilla. Lysosomaalisten proteiinien tunteminen on ehdoton edellytys lysosomien toiminnan parempaan ymmärtämiseen ja uusien hoitomuotojen kehittämiseen lysosomeihin liittyviin tauteihin. Tässä väitöskirjassa lysosomaalisia proteiineja on tutkittu lähinnä rakennetutkimuksen menetelmillä. Väitöskirjatyö käsitti sekä perustutkimusta lysosomaalisista proteiineista että tuotti tietoa, jota voidaan hyödyntää uusia terapiamuotoja edelleen kehitettäessä. Yksi väitöskirjan tutkimusaiheista oli fosfolipaasi B:n kaltainen 1- proteiini (PLBD1). Tässä tutkimuksessa varmistui että tämä aiemmin huonosti tunnettu proteiini on yksi lysosomin entsyymeistä. Sen on esitetty pilkkovan fosfolipidejä, mutta tässä työssä ratkaistu PLBD1:n kolmiulotteinen rakenne osoittaa, ettei proteiini voi olla fosfolipaasi, vaan PLBD1 toimii sen sijaan amidaasina. PLBD1:n rakenteen tunteminen auttaa sen luonnollisen substraatin löytämisessä. Lisäksi rakenneanalyysi auttaa selvittämään liittyykö PLBD1:tä koodaavan geenin mutataatioihin lysosomaalinen kertymätauti. Toinen keskeinen aihealue väitöskirjassa oli lysosomaalisten proteiinien yhteisten piirteiden analysointi etenkin lysosomaalista kertymätautia aiheuttavien mutaatioiden osalta. Lysosomaalista kertymätautia aiheuttavien mutaatioiden analyysi neljästä proteiinista osoitti, että mutaatiot eivät ole tasaisesti jakaantuneet 20 aminohapon kesken, vaan että toisissa aminohapoissa kuten glysiinissä tautia aiheuttavia mutaatioita esiintyy huomattavasti useammin kuin aminohapon esiintyvyyden perusteella voisi odottaa. Näiden mutaatioiden tarkastelu proteiinirakenteessa osoittaa, että niillä on ainutlaatuisia ominaisuuksia, jotka ovat proteiinin rakenteelle niin tärkeitä ettei niitä voi korvata toisten aminohappojen ominaisuuksilla. Kolmas aihealue väitöskirjassa keskittyi siihen, miten inhibiittorit stabilisoivat lysosomaalista α-glukosidaasi (GAA) proteiinia. Mutaatiot GAA:ta koodaavassa geenissä aiheuttavat Pompen tautia, joka on yksi lysosomaalisista kertymätaudeista. Uusi mahdollinen hoitomuoto Pompen taudille on kaitsijamolekyylihoito, jossa pienimolekyylisten ligandien kuten inhibiittorien sitoutuminen GAA:han lisää sen määrää lysosomeissa. Väitöskirjatyö osoitti, että GAA:ta pystytään stabiloimaan useilla eri inhibiittoreilla, joiden GAA:n stabilisointikyky vaihtelee. Sijoittamalla nämä molekyylit GAA:n proteiinirakenteen malliin pystyimme osoittamaan piirteitä, jotka tulisi ottaa huomioon kehitettäessä uusia vielä tehokkaampia kaitsijamolekyylejä lääketarkoitukseen.
Subject: rakennebiologia
perinnöllisyystiede
Rights: This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
structur.pdf 3.141Mb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record