Enhanced Antibacterial Action of Bacteriocin Producing Cells by Binding to the Target Pathogen

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:ISBN:978-952-10-9993-9
Title: Enhanced Antibacterial Action of Bacteriocin Producing Cells by Binding to the Target Pathogen
Author: Liu, Shanna
Other contributor: Helsingin yliopisto, maatalous-metsätieteellinen tiedekunta, elintarvike- ja ympäristötieteiden laitos
Helsingfors universitet, agrikultur-forstvetenskapliga fakulteten, institutionen för livsmedels- och miljövetenskaper
University of Helsinki, Faculty of Agriculture and Forestry, Department of Food and Environmental Sciences
Publisher: Helsingin yliopisto
Date: 2014-08-15
Language: en
URI: http://urn.fi/URN:ISBN:978-952-10-9993-9
http://hdl.handle.net/10138/135387
Thesis level: Doctoral dissertation (article-based)
Abstract: Bacteriocins are natural weapons of bacterial inter-species competition in food preservation arsenal. Bacteriocins produced by lactic acid bacteria have gained particular attention owing to their potential application as the substitute of artificial chemical preservatives. This research made use of genetic engineering technologies to clone the class IIa bacteriocin genes and construct bacteriocin structural gene expression systems, aiming at solving the problem of low bacteriocin production in wild type lactic acid bacteria strains and achieving efficient killing of Listeria monocytogenes. The total DNA of Pediococcus acidilactici PA003 was used as the template to amplify the structural gene pedA, which was inserted into pET32a(+) vector and transformed into Escherichia coli. The recombinant plasmid containing the pedA gene was verified by DNA sequencing. This recombinant strain was induced with IPTG and it efficiently expressed a 22 kDa Trx-PedA fusion protein as inclusion bodies. One protein band corresponding to the predicted molecular mass of pediocin was obtained after renaturation and enterokinase treatment. The agar diffusion assay revealed that 512 arbitrary unit (AU) antilisterial activities were obtained from 1 ml culture of recombinant E. coli. The same strategy was adopted using pET20b(+) as the expression vector. The PelB signal peptide in this vector resulted in soluble expression of fusion protein both in the intracellular and periplasmic space with totally 384 AU/ml production. Lactococcus lactis cells were engineered to bind to cellulose by fusing cellulose-binding domain of Cellvibrio japonicus with PrtP, NisP and AcmA anchors for surface display. The CBD-PrtP showed the most efficient immobilization. Expression of sortase with the CBD-PrtP fusion did not improve binding of the anchor to the cell wall. Next, the surface display technique was aimed to be combined with secretion of antilisterial bacteriocins in order to construct an E. coli strain with capacity to bind and kill L. monocytogenes cells. Such cells could be used to test the hypothesis that antilisterial bacteriocin secreting cells kill listerial cells more efficiently if they also have the capacity to bind to listerial cells. Therefore, the CBD500 and CBDP35 cell-wall binding domains from Listeria phage endolysins were used to engineer E. coli cells to bind to L. monocytogenes cells using different cell anchoring domains. First CBD500 was fused to the outer membrane anchor of Yersinia enterocolitica adhesin YadA for potential surface display. Whole-cell ELISA showed that CBD-YadA fusion was displayed on the cell surface. However, production of the fusion protein was detrimental to the growth of recombinant cells. Therefore, a fragment of the E. coli outer membrane protein OmpA was selected for fused expression of CBD500 in E. coli. Western blot revealed the OmpA-CBD was mainly localized on the external surface of recombinant cells. However, the accessibility of the CBD on the cell envelope to cells of Listeria could not be shown. For an improved surface display, CBD was expressed as FliC CBD chimeric protein in flagella. CBD500 and CBDP35 domain coding sequences were inserted into vector pBluescript/fliCH7. CBD insertion in flagella was confirmed by Western blot. The FliC CBDP35 flagella were isolated and shown to bind to L. monocytogenes WSLC 1019 cells. To test the hypothesis that bacteriocin-secreting cells kill target cells more efficiently by binding to the target cells, bacteriocin-secreting strains with binding ability to Listeria cells were constructed. Antilisterial E. coli was obtained either by transferring pediocin production from Lactobacillus plantarum WHE 92 or leucocin C production from Leuconostoc carnosum 4010. The Listeria-binding cells producing pediocin decreased approximately 40 per cent of the Listeria cells during three hours, whereas the cell-free medium with the corresponding amount of pediocin could only inhibit cell growth but did not decrease the number of viable Listeria cells after the three hours incubation. The cell-mediated leucocin C killing resulted in a two-log reduction of Listeria, whereas the corresponding amount of leucocin C in spent culture medium could only inhibit growth without bacteriocidal effect. These results indicate that close contact between Listeria and bacteriocin-producing cells is beneficial for the killing effect by preventing its dilution in the environment and adsorption onto particles before taking effect to the target cells.Bakteriosiinit ovat luonnollisia aseita lajienvälisessä kilpailussa elintarvikkeissa. Maitohappobakteerien tuottamat bakteriosiinit ovat olleet erityisen huomion kohteena niiden keinotekoisten kemiallisten säilöntäaineiden korvaamispotentiaalin takia. Tutkimuksissani hyödynsin geenimuokkausta kloonatessani ja tehdessäni luokka IIa bakteriosiiniituottosysteemit yrittäessäni ratkoa villityypin maitohappobakteerikannan matalan bakteriosiinintuottotason ongelmaa saaden tehokasta Listeria monocytogenes bakteerin tappoa aikaiseksi. Käytin Pediococcus acidilactici PA003 kannan totaali-DNA:ta templaattina amplifioiden rakennegeeniä pedA, jonka insertoin pET32a(+) vektoriin ja transformoin Escherichia coli -bakteeriin. DNA-sekvensoinnilla varmennettua pedA- rekombinattiplasmidia indusoin IPTG:llä johtaen 22 kDa Trx-PedA fuusioproteiinin tuottoon inkluusiopartikkeleina. Inkluusiopartikkelit käsittelin enterokinaasilla ja renaturoin, jolloin SDS-PAGE-analyysilla osoitin yhden proteiinikertymän liikkuneen geelissä korreloiden ennustetun proteiinin molekyylimassan mukaisesti. Yksi ml rekombinantti-E. coli viljelmää tuotti 512 yksikköä (AU) antilisteria-aktiviteettia. Samaa strategiaa käytin pET20b(+) PelB-signaalisekvenssiä hyödyntävällä sekreetiovektorilla. Tällä vektorilla fuusioproteiini säilyi liukoisena tuottaen yhteensä 384 AU/ml pediosiiniaktiviteettia syto- ja periplasmaan. Muokkasin Lactococcus lactis -soluja sitoutumaan selluloosaan fuusiomalla selluloosaasitovaan osan (CBD) Cellvibrio japonicus bakteerista PrtP-, NisP- ja AcmA-ankkuriosiin pintaekspressiota varten. CBD-PrtP-osa johti parhaaseen immobilisaatioon. Sortaasin ja CBD-PrtP-fuusion yhteistuotto ei lisännyt fuusioproteiinin ankkuroitumista soluseinään. Seuraavaksi yhdistin pintaekspressioteknikoita antilisteriabakteriosiinien sekreetioon voidakseeni konstruoida E. coli kanta, joka sitoutuu L. monocytogenes soluihin ja tappaa ne. Sellaisilla soluilla voidaan testata listeriasoluihin sitoutuva antilisteriabakteriosiinia sekretoiva solu tappaa tehokkaammin kuin vastaava solu, joka ei sitoudu listeriasoluihin hypoteesi. Tämän takia käytin CBD500 and CBDP35 soluseinään sitoutuvat osat Listeria-faagin endolysiineistä muokatakseni E. coli soluja sitoutumaan L. monocytogenes bakteeriin. Ensin fuusioin CBD500 Yersinia enterocolitica bakteerin ulkomembraaniproteiini adhesiini-YadA:han pintaekspressiota varten. Kokosolu-ELISA osoitti että CBD-YadA fuusio tuottui solujen pintaan. Toisaalta fuusioproteiinin tuotto haittasi solujen toimintaa heikentäen solujen kasvua. Tämän takia valitsin toisen ulkomembraaniproteiiniosan, E. coli bakteerin OmpA-osan, CBD500 fuusiopartneriksi E. coli isännässä. Western blot analyysi osoitti että OmpA-CBD tuottui hyvin solujen ulkomembraaniin, mutta niiden hyvää esilläoloa ei voitu osoittaa. Saavuttaakseni parempaa listeriasoluun tarttuvan CBD-osan presentaatiota, tuotin CBD FliC CBD-kimeerinä flagellassa. Insertoin CBD500- ja CBDP35-koodaavat osat vektoriin pBluescript/fliCH7. Varmistin CBD-insertion flagellassa Western analyysilla. Eristin FliC CBDP35-flagellat ja osoitin niiden sitoutuvan L. monocytogenes WSLC 1019 -soluihin. Listeriasoluihin sitoutuva antilisteriabakteriosiinia sekretoiva solu tappaa tehokkaammin kuin vastaava solu, joka ei sitoudu listeriasoluihin hypoteesin paikkaansapitävyyden testaukseen siirsin vielä listeriasoluihin tarttuviin E. coli kantoihin antilisteriabakteriosiinin sekreetiokyvyn. Antilisteria E. coli kannat sain aikaiseksi siirtämällä pediosiinituottoa Lactobacillus plantarum WHE 92 tai leukoksiini C tuottoa Leuconostoc carnosum 4010 -kannoista. Listeriaan sitoutuvat ja pediosiiniä tuottavat solut vähensivät elävien listeriasolujen määrää 40 prosenttia kolmessa tunnissa, kun kolmen tunnin inkubointi vastaavan määrän pediosiiniä sisältävässä soluvapaassa kasvatusalustassa ainoastaan inhiboi kasvua muttei vähentänyt elävien listeriasolujen määrää. Soluvälitteinen leukoksiini C tappo johti kahden logaritmin listeriavähennykseen, kun vastaava määrä leukoksiini C:tä soluvapaassa kasvatusliemessa vain inhiboi listerioiden kasvua vailla bakteriosidistä vaikutusta. Nämä tulokset viittaavat siihen, että lähikontakti listerian ja bakteriosiiniatuovien solujen kanssa edesauttavat tappovaikutusta, johtuen mahdollisesti vähäisemmästä bakteriosiinin laimenemisesta ympäristöön ja adsoptiosta muihin pintoihin ennen sitoutumista kohdesoluihiinsa.
Subject: microbiology
Rights: Julkaisu on tekijänoikeussäännösten alainen. Teosta voi lukea ja tulostaa henkilökohtaista käyttöä varten. Käyttö kaupallisiin tarkoituksiin on kielletty.


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
enhanced.pdf 2.932Mb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record