Glucuronidation of estrone and 16alfa-hydroxyestrone

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:NBN:fi-fe201801151257
Title: Glucuronidation of estrone and 16alfa-hydroxyestrone
Author: Kallionpää, Roope
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Pharmacy
Publisher: Helsingfors universitet
Date: 2014
Language: eng
URI: http://urn.fi/URN:NBN:fi-fe201801151257
http://hdl.handle.net/10138/135717
Thesis level: master's thesis
Discipline: Farmaceutisk kemi
Pharmaceutical Chemistry
Farmaseuttinen kemia
Abstract: Estrogens are female sex hormones that have genotoxic and proliferation-enhancing effects in cells. Life-time exposure to estrogens is linked to the risk of several cancers. Estrone is only a weak agonist of estrogen receptor but it serves as a precursor for biosynthesis of 17β-estradiol, 16α-hydroxyestrone and catechol estrogens. While 16α-hydroxyestrone has relatively weak affinity for estrogen receptor, it has prolonged effect due to covalent binding to the receptor. UDP-glucuronosyltransferases (UGTs) are phase II metabolic enzymes that conjugate estrogens with glucuronic acid to render them more watersoluble. Polymorphisms in UGT genes have been linked to excretion of steroids and risk of some cancers. Generally, subfamily UGT1A enzymes conjugate the 3-hydroxyls of estrogens, while the activity of subfamily UGT2B is directed towards 16- and 17-hydroxyls. Previous results on estrone glucuronidation are incomplete and conflicting, while glucuronidation of 16α-hydroxyestrone has not been systematically studied. The aim of this study was to identify UGTs active in the glucuronidation of estrone and 16α-hydroxyestrone and to further examine the glucuronidation kinetics of the active UGTs. Also the effects of bovine serum albumin (BSA), dimethyl sulfoxide (DMSO) and mutations of UGT1A10F90 and UGT1A10F93 on glucuronidation activity were examined. Activity assays were conducted using recombinant enzymes as well as human liver and intestinal microsomes. Resulting glucuronides were analyzed using high performance liquid chromatography and quantified based on their UV absorbance. UGT1A3, UGT1A10 and UGT2A1 showed the highest activity toward estrone glucuronidation, while UGT1A10, UGT2A1 and UGT2B7 were the most efficient UGTs conjugating 16α-hydroxyestrone. UGT1A10 had the highest Vmax in the glucuronidation of both substrates, although it conjugated estrone at a higher rate than 16α-hydroxyestrone. UGT1A10F93 was shown to have a role in the different glucuronidation activities of UGT1A10 toward estrone and 16α-hydroxyestrone. Affinity of 16α-hydroxyestrone was highest for UGT2B7, while UGT2B17 conjugated 16α-hydroxyestrone relatively slowly. The results confirm earlier observations of the preference of UGT2B7 for α-configured hydroxyls while UGT2B17 favors β-configuration. UGT2A1 showed no strict regioselectivity but had a relatively weak affinity for both substrates. DMSO was found to decrease UGT activity. However, its presence is necessary to solubilize lipophilic substrates. DMSO concentration has to be kept constant to produce comparable data for, for example, kinetic studies. BSA was found to alter especially the kinetics of UGT2A1. BSA also seemed to have solubility-enhancing effect.Estrogeenit ovat naissukupuolihormoneja, joilla on sekä perimää vaurioittavia että solujen jakautumista kiihdyttäviä vaikutuksia. Elämänaikainen estrogeenialtistus liittyy useiden syöpien kehittymiseen. Estroni on estrogeenireseptorin heikko agonisti, mutta se on 17β-estradiolin, 16α-hydroksiestronin ja katekoliestrogeenien biosynteesin lähtöaine. Vaikka 16α-hydroksiestronilla on heikko affiniteetti estrogeenireseptoriin, se sitoutuu reseptoriin kovalenttisesti ja vaikuttaa muita estrogeeneja pidempään. UDP-glukuronosyylitransferaasit (UGT:t) ovat faasin II metaboliaentsyymejä, jotka liittävät estrogeeneihin glukuronidihapon tehden niistä vesiliukoisempia. UGT-geenien polymorfiat liittyvät steroidien erittymiseen kehosta ja joidenkin syöpien kehitykseen. UGT1A-alaperheen entsyymit glukuronidoivat pääsääntöisesti estrogeenien 3-hydroksyyliä, kun taas UGT2B-alaperheen aktiivisuus kohdistuu 16- ja 17-hydroksyyleihin. Estronin glukuronidaatiosta julkaistut tulokset ovat epätäydellisiä ja ristiriitaisia, kun taas 16α-hydroksiestronin glukuronidaatiota ei ole aiemmin tutkittu järjestelmällisesti. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tunnistaa estronia ja 16α-hydroksiestronia glukuronidoivat UGT:t ja tarkastella aktiivisten entsyymien glukuronidaatiokinetiikkaa. Lisäksi tutkittiin naudan seerumin albumiinin (BSA), dimetyylisulfoksidin (DMSO) ja aminohappojen UGT1A10F90 ja UGT1A10F93 vaikutusta glukuronidaatioaktiivisuuteen. Aktiivisuusmittauksissa käytettiin sekä rekombinanttientsyymejä että ihmisen maksa- ja suolistomikrosomeja. Syntyneet glukuronidit analysoitiin korkean suorituskyvyn nestekromatografialla ja kvantitoitiin UV-absorbanssin perusteella. UGT1A3, UGT1A10 ja UGT2A1 olivat aktiivisimpia estronin glukuronidaatiossa, ja UGT1A10, UGT2A1 ja UGT2B7 konjugoivat 16α-hydroksiestronia tehokkaimmin. UGT1A10:llä oli korkein Vmaxarvo molempien substraattien konjugaatiossa, vaikka se glukuronidoi estronia nopeammin kuin 16α-hydroksiestronia. Osoittautui, että UGT1A10F93 vaikuttaa estronin ja 16α-hydroksiestronin erilaiseen glukuronidaationopeuteen. 16α-hydroksiestronin affiniteetti oli korkein UGT2B7:ään, kun taas UGT2B17 konjugoi 16α-hydroksiestronia suhteellisen hitaasti. Tulokset tukevat aiempien tutkimusten havaintoja, joiden mukaan UGT2B7 suosii α-konfiguraatiossa olevia hydroksyylejä, kun taas UGT2B17 on tehokkaimmillaan β-hydroksyylien glukuronidoimisessa. UGT2A1:n toiminnassa ei havaittu selvää regioselektiivisyyttä, mutta sillä oli varsin heikko affiniteetti kumpaakin substraattia kohtaan. DMSO:n havaittiin heikentävän UGT:iden aktiivisuutta. Sen käyttö oli kuitenkin välttämätöntä lipofiilisten substraattien liuottamiseksi. DMSO:n pitoisuus on pidettävä vakiona vertailukelpoisten tulosten tuottamiseksi esimerkiksi kineettisiä tutkimuksia varten. BSA muutti erityisesti UGT2A1:n kinetiikkaa, ja myös sillä oli substraattien liukoisuutta parantava vaikutus.
Subject: UGT
estrogen
estrone
16α-hydroxyestrone
UDP-glucuronosyltransferase
glucuronidation


Files in this item

Files Size Format View

There are no files associated with this item.

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record