The regulation of U12-dependent splicing and its significance to mRNA stability

Show full item record

Permalink

http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-51-0208-9
Title: The regulation of U12-dependent splicing and its significance to mRNA stability
Author: Niemelä, Elina
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Biological and Environmental Sciences, Department of Biosciences
University of Helsinki, Institute of Biotechnology
Thesis level: Doctoral dissertation (article-based)
Belongs to series: Dissertationes Scholae Doctoralis Ad Sanitatem Investigandam Universitatis Helsinkiensis - URN:ISSN:2342-317X
Abstract: The removal of noncoding sequences, or introns, from eukaryotic messenger RNAs is an essential step in the expression of genetic information. Two types of introns are removed by dedicated spliceosomes. The majority of introns are spliced by the U2-dependent spliceosome, whereas a small fraction of introns, less than 0.5%, are removed by a dedicated U12-dependent spliceosome. Although the two splicing pathways are highly similar, differences exist in the initial step of intron recognition. The rationality of maintaining parallel spliceosomes has remained unclear and is thought to stem from the suggested regulatory functions of the minor type introns. The U12-dependent spliceosome removes introns at a slower rate than the major spliceosome, and therefore the minor introns may constitute a rate-limiting step in the processing of the mRNA. In this work, I have investigated the regulation of the minor spliceosome via a negative feedback loop that relies on alternative splicing and nonsense mediated decay. Pre-mRNAs encoding U11-48K and U11/U12-65K proteins of the minor intron recognition particle, U11/U12 small nuclear RNP, are alternatively spliced. Alternative splice site usage is activated upon binding of the U11/U12 di-snRNP on regulatory motifs resembling bona fide spliceosomal 5ʹ splice sites. The alternative isoforms contain premature termination codons leading to destabilization of the transcript in question, or display differential cellular localization. I have further characterized the splicing regulatory element and the role of U11-35K protein required for its activation. The findings point to the existence of a considerable selection pressure maintaining the important motifs of the regulatory element, as both the motifs and their location relative to each other are highly conserved in distant organisms and can be found both in animals and plants, highlighting the importance of regulating the intron recognition step of the U12-dependent splicing pathway. The rate-limiting characteristics of U12-type introns are well known but earlier works have investigated only a small number of introns. In the final part of this work, RNA sequencing was performed and the results confirm that U12-type introns are less efficiently removed on a transcriptome-wide scale. I also investigated a hypothesis suggesting that slowly processed mRNAs are targeted by nuclear decay. Following the inactivation of RNA exosome components, transcripts with unspliced U12-type introns are stabilized while U2-type introns in the same transcripts remain unaffected. This supports the results from previous work on the delayed processing of U12-type introns and indicates a mechanism for their role in the regulation of eukaryotic gene expression.Aitotumallisten eliöiden, kuten eläinten ja kasvien, geeneille on tyypillistä koodaavien jaksojen jakautuminen useampaan osaan, joita kutsutaan eksoneiksi. Eksonien välisiä, koodaamattomia jaksoja puolestaan kutsutaan introneiksi, joiden poisto eli silmukointi on välttämätöntä oikean proteiinin tuottamiseksi. Useilla aitotumallisilla esiintyy kahdenlaisia introneita, joista huomattavasti yleisempiä ovat U2-tyypin intronit. U12-tyypin introneita on vain noin 0,5 % ihmisen kaikista introneista, ja silti niiden poistoa varten on erikoistunut, ns. U12-tyypin spliseosomi. Mekanismiltaan ja kompositioltaan spliseosomit ovat huomattavan samalaisia keskenään, lukuun ottamatta snRNA-molekyylejä sekä joitakin proteiineja U11/U12 di-snRNP-kompleksissa, joka sitoutuu U12-tyypin intronien tunnistussekvensseihin. Kahden päällekkäisen silmukointikompleksin olemassaoloa on selitetty mm. U12-tyypin silmukoinnin hitaudella, jonka johdosta U12-tyypin introneita sisältävien geenien ilmentymistä voisi säädellä erikseen. Väitöskirjassani olen tutkinut U11/U12 di-snRNP:n itsesäätelyä, joka toimii di-snRNP:n proteiineja 48K:ta ja 65K:ta koodaavien geenien introneissa olevien, vaihtoehtoista silmukointia säätelevien tunnistussekvenssien avulla. Vaihtoehtoinen silmukointi aktivoituu, kun 48K-proteiinia on runsaasti, ja aiheuttaa lähetti-RNA-molekyylien tuhoutumisen ns. nonsense mediated decay mekanismilla (48K) tai lähetti-RNA:n jäämiseen tumaan (65K), missä se ei voi ohjata proteiinisynteesiä. Olen myös tutkinut kyseistä vaihtoehtoista silmukointia kontrolloivan sekvenssin (lyh. USSE, U11 snRNP-binding splicing enhancer) esiintymistä ja variaatiota eri lajeissa sekä proteiineja, jotka vaikuttavat aktivaatioon. Erityisesti 35K-proteiinilla ja sen SR-domeenilla huomattiin olevan tärkeä rooli aktivaation välittäjänä. Havaittiin, että USSE-sekvenssissä on tiettyjä kriittisiä etäisyysparametreja, joiden säilyttäminen on tärkeää säätelyn kannalta. Lisäksi tulokset viittaavat siihen, että USSE:n molemmat osiot ovat välttämättömiä ja todennäköisesti kaksi snRNP:ta sitoutuu niihin samanaikaisesti. U12-tyypin silmukoinnin hitauden vaikutusta geenien ilmentymiseen tutkittiin osatyössä, jossa tiettyjen tuman RNA-hajotusentsyymien (eksosomin) inaktivoinnin jälkeen sekvensoitiin tuman RNA-molekyylejä ja analysoitiin intronien retentiota sekä poiston kinetiikkaa. Työssä havaittiin, että U12-tyypin introneita poistetaan hitaammin ja osa niitä sisältävistä lähetti-RNA:ista hajotetaan jo tumassa. U12-tyypin intronien poiston kinetiikan todettiin tutkituissa tapauksissa olevan huomattavasti hitaampaa ja reagoivan voimakkaammin eksosomin inaktivaatioon kuin yleisten intronien. Tulokset sopivat yhteen aiemmin julkaistujen yksittäistapausten kanssa ja osaltaan selittävät rinnakkaisen spliseosomin tarvetta.
URI: URN:ISBN:978-951-51-0208-9
http://hdl.handle.net/10138/135929
Date: 2014-10-10
Subject: biokemia
Rights: This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
theregul.pdf 789.6Kb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record