Isolation and characterisation of lignin from steam pretreated spruce and its utilisation to study cellulase adsorption on lignin

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-201507211633
Title: Isolation and characterisation of lignin from steam pretreated spruce and its utilisation to study cellulase adsorption on lignin
Author: Rahikainen, Jenni
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Agriculture and Forestry, Department of Applied Chemistry and Microbiology
Publisher: Helsingfors universitet
Date: 2009
Language: eng
URI: http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-201507211633
http://hdl.handle.net/10138/14139
Thesis level: master's thesis
Discipline: Mikrobiologi
Bioteknik
Microbiology
Biotechnology
Mikrobiologia
Biotekniikka
Abstract: Environmental concerns and limited availability of fossil hydrocarbons have boosted the research of renewable feedstocks and their processing into fuels and chemicals. Currently, vast majority of transportation fuels and bulk chemicals are refined from crude oil, but renewable lignocellulosic plant biomass has long been recognised as potential feedstock for liquid fuel and chemical production. Several alternative processes exist for biomass refining, lignocellulose-to-ethanol process being among the most studied processes. First, lignocellulose is pretreated in order to deconstruct the recalcitrant structures of plant cell walls and expose cellulosic fibrils. Subsequently, biotechnical process utilises cellulolytic enzymes of fungal origin to depolymerise cellulose down to glucose monomers and oligomers. Monomeric sugars serve as a source for platform chemicals in further conversions. Lignocellulose consists mainly of cellulose, hemicellulose and lignin. It is generally accepted that lignin has an inhibitory effect during enzymatic hydrolysis of cellulose and part of this effect is caused by irreversible cellulase adsorption on lignin. Fungal cellulase system consists of several enzyme components that contribute to the effective degradation of insoluble cellulosic substrate. Cellulases are traditionally divided to three groups according to enzymatic activity: exoglucanases, endoglucanases and ?-glucosidases. Different enzyme components are shown to have different affinity to lignin which enables screening or engineering of weak lignin-binding enzymes. However, too little is still known about enzyme-lignin interactions and competitive nature of enzyme binding on lignin. In this study, lignin-rich residues were isolated from steam pretreated spruce (SPS) using three different methods: enzymatic hydrolysis, acid hydrolysis and alkali extraction. Lignin residues were characterized and used in adsorption studies with commercial cellulase preparations from Trichoderma reesei (Celluclast 1.5L) and Aspergillus niger (Novozym 188). Enzyme activity measurements and protein analytics were employed to reveal competitive adsorption of cellulases and catalytic activity of solid-bound enzymes. Results showed that T. reesei enzymes had high affinity on lignocellulosic SPS and all SPS-derived lignins, but enzyme activity measurements revealed considerably divergent competitive adsorption patterns. Among all the isolated lignins, lignin-rich residue obtained by enzymatic hydrolysis of SPS and subsequent protease purification was evaluated as most suited adsorption substrate for further adsorption studies and screening purposes. ?-glucosidases from T. reesei and A. niger were shown to have highly distinctive adsorption behaviour on the lignin-rich substrates: A. niger ?-glucosidase lacked affinity to lignin, whereas T. reesei ?-glucosidase adsorbed to all lignin-rich particles. Lignin-bound Trichoderma reesei endoglucanases and CBH I exoglucanase were shown to retained high activity towards soluble substrates used in activity measurements. On the contrary, same enzymes were unable to processively hydrolyze insoluble crystalline cellulose.Fossiilisten hiilivetyjen käyttö nestemäisten polttoaineiden, kemikaalien ja materiaalien tuotannossa on ympäristön ja materiaalin rajallisen määrän vuoksi kestämätön ratkaisu. Tästä johtuen uusiutuvien luonnonvarojen hyödyntämiseen tähtäävä tutkimus on lisääntynyt merkittävästi viime vuosina. Tällä hetkellä valtaosa liikenteen polttoaineista sekä kemikaaleista tuotetaan raakaöljystä, mutta tulevaisuudessa tuotteita saatetaan jalostaa kasvien tuottamasta lignoselluloosasta. Lignoselluloosan jalostukseen on olemassa useita prosessivaihtoehtoja, joista etanolin tuotanto on yksi tutkituimpia. Prosessissa lignoselluloosan rakenne hajoitetaan esikäsittelyllä, jolloin kasvin soluseinien rakenne aukeaa ja selluloosakuidut työntyvät rakenteesta esille. Bioteknisessä prosessissa selluloosapolymeeri hajotetaan entsymaattisesti sienten selluloosaa hajoittavilla entsyymeillä. Hydrolyysin tuloksena syntyneet glukoosimonomeerit sekä oligomeerit ovat reaktiivisia molekyylejä, jotka voidaan prosessoida esimerkiksi etanoliksi. Lignoselluloosa koostuu pääosin selluloosasta, hemiselluloosasta ja ligniinistä. Ligniinin tiedetään estävän selluloosan entsymaattista hydrolyysiä, minkä on huomattu johtuvan osin sellulaasien tarttumisesta ligniiniin. Kiinteän selluloosan hajoitukseen tarvitaan erityyppisiä sellulaaseja, jotka hajoittavat synergisesti selluloosapolymeeriä. Nämä entsyymit jaotellaan aktiivisuuden perusteella endoglukanaaseihin, eksoglukanaaseihin sekä ?-glukosidaaseihin. Kullakin entsyymillä on yksilöllinen taipumus sitoutua ligniiniin, mikä mahdollistaa ligniiniin heikosti sitoutuvien entsyymien seulonnan tai proteiinimuokkauksen käyttämisen hydrolyysiin soveltuvia entsyymejä kehitettäessä. Ligniini-entsyymi -vuorovaikutuksesta sekä usean sellulaasin kompetitiivisesta adsorptiosta tiedetään kuitenkin melko vähän. Tässä tutkimuksessa höyryräjäytetystä kuusesta eristettiin ligniinipartikkeleja kolmella eri menetelmällä: entsymaattisella hydrolyysillä, happohydrolyysillä sekä emäskäsittelyllä. Partikkelien ominaisuuksia tutkittiin ja niitä käytettiin substraatteina adsorptiokokeissa. Trichoderma reesei (Celluclast 1.5L) sellulaasivalmistetta sekä Aspergillus niger (Novozym 188) ?-glukosidaasivalmistetta käytettiin sellulaasien sitoutumisominaisuuksien vertailuun. Entsyymiaktiivisuusmäärityksiä sekä proteiinianalytiikkaa käytettiin eri entsyymiryhmien adsorption vertailuun sekä ligniinissä kiinni olevien entsyymien katalyyttisen aktiivisuuden tutkimiseen. Tulokset osoittivat, että Trichoderma reesein entsyymit sitoutuvat huomattavan paljon höyryräjäytettyyn kuuseen sekä siitä eristettyihin ligniinifraktioihin. Entsyymiaktiivisuusmittaukset kuitenkin osoittivat eri aktiivisuuksien sitoutuvan ligniini- ja selluloosapartikkelihin eri määriä. Eri tavoin eristettyjen ligniininäytteiden välillä ei pystytty havaitsemaan merkittäviä eroja entsyymien kiinnittymisessä. Merkittävä ero havaittiin kuitenkin kahden eri alkuperää olevan entsyymivalmisteen välillä: T. reesei ?-glukosidaasi kiinnittyi ligniinipartikkeleihin huomattavasti enemmän kuin A. niger ?-glukosidaasi, joka ei adsorboitunut testatuille partikkeleille. Ligniiniin sitoutuneiden T. reesein endoglukanaasien ja eksoglukanaasien aktiivisuus osoittautui säilyvän hyvin immobilisoinnista huolimatta, mutta kiinteän selluloosasubstraatin hydrolyysi oli vaatimatonta ligniiniin sitoutuneilla entsyymeillä. Höyryräjäytetystä kuusesta eristettyjen ligniinipartikkelien hyödyntämistä arvioitiin myös tulevien adsorptiokokeiden kannalta. Entsymaattisella hydrolyysillä eristetyn ja proteaasilla puhdistetun näytteen arvioitiin soveltuvan parhaiten jatkotutkimuksiin.
Subject: cellulase
lignin
inhibition
enzyme adsorption
enzymatic hydrolysis
steam pretreated spruce
sellulaasi
ligniini
inhibitio
entsyymiadsorptio
entsymaattinen hydrolyysi
höyryräjäytetty kuusi


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
Master's_Thesis_Jenni_Rahikainen.pdf 1.919Mb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record