Konventionaalinen Raman-spektroskopia ja aika-erotteinen Raman-spektroskopia lääkeaineiden ja biomolekyylien tutkimuksessa (kirjallisuuskatsaus) : Konventionaalinen Raman-spektroskopia ja aika-erotteinen Raman-spektroskopia ei-fluoresoivien ja fluoresoivien lääkeaineiden tutkimuksessa (kokeellinen osuus)

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:NBN:fi-fe201801151281
Title: Konventionaalinen Raman-spektroskopia ja aika-erotteinen Raman-spektroskopia lääkeaineiden ja biomolekyylien tutkimuksessa (kirjallisuuskatsaus) : Konventionaalinen Raman-spektroskopia ja aika-erotteinen Raman-spektroskopia ei-fluoresoivien ja fluoresoivien lääkeaineiden tutkimuksessa (kokeellinen osuus)
Author: Rojalin, Tatu
Other contributor: Helsingin yliopisto, Farmasian tiedekunta
University of Helsinki, Faculty of Pharmacy
Helsingfors universitet, Farmaceutiska fakulteten
Publisher: Helsingfors universitet
Date: 2015
Language: fin
URI: http://urn.fi/URN:NBN:fi-fe201801151281
http://hdl.handle.net/10138/152768
Thesis level: master's thesis
Discipline: Biofarmaci
Biopharmacy
Biofarmasia
Abstract: Raman spectroscopy is based on vibrations that occur between the atoms of a compound. The overall structural energy is derived from the electronical energy as well as vibrational, rotational and translational energy. In Raman spectroscopy the vibrational and rotational energies are essential. Usually the excitation energy used in Raman spectroscopy can be either in the region of visible light or NIR. The sample absorbs the energy and energy is also scattered back to all possible directions. Elastic scattering is called the Rayleigh scattering. In that case the back-scattered photons have an equal energy as the original excitation energy. However, some of the scattering happens inelastically and it forms the basis of Raman-phenomena. If the detected photons have smaller energy than the original, it is called the Stokes scattering. If the energy is bigger, it is anti-Stokes scattering. Raman is typically very rare and weak phenomenon. The spectral features in Raman spectra consist of the intensities and energies of the back scattered photons. Raman spectroscopy provides very accurate and detailed structural information on the molecule. It is basically a label-free technique with minimal need for sample preparation and the measurements can also be carried out e.g. through container walls. Further, Raman is quite insensitive to hydrous samples and it is suitable to solutions and biological assessments. However, there are some drawbacks that are formed by the luminescence phenomena i.e. fluorescence. Strong fluorescent backgrounds can mask the relevant Raman features in spectra because Raman and fluorescence are competetive processes. For instance many drug molecules have such structures that they cause strong fluorescence. It is also one of the reasons that pharmaceutical applications and measurements have been partly limited due to this problem. There are applications to improve and enhance a Raman signal. For example resonance phenomena and SERS are favored. To solve the fluorescence-related problems there are also means; one can change the laser wavelenght, photobleach the sample or apply different kinds of data manipulation techniques to the spectral data achieved. There are drawbacks with these methods. They can be slow, complex, damage the samples and still insufficient fluorescence suppression is a problem. In this study a novel time-gated CMOS-SPAD detection technique is applied to non-fluorescent and fluorescent drug measurements. The new detection system has a programmable on-chip delay time and it is synchronized with a picosecond pulsed laser. The scattered photons can be measured in the time scale when they are simultaneously measured in traditional energy and intensity wise. Raman scattering occurs in the timescale of sub-picoseconds while the fluorescence phenomena happen typically in the order of nanoseconds. This time difference can be exploited effectively to suppress the fluorescence. In the literature review of this study the basis of vibrational spectroscopy is introduced - especially Raman spectroscopy. The techniques related, as well as the novel time-resolved technique are covered. Further, different kinds of applications in the field of Raman spectroscopy are reviewed, mainly pharmaceutics-related and biologically relevant applications. In the experimental work the focus was to compare a continuous-wave 785 nm laser setup coupled with the CCD-detector to the pulsed picosecond 523 nm laser coupled with the CMOS-SPAD-detector. The measurements were performed on different kinds of drugs, both non-fluorescent and fluorescent. The aim was to obtain information on the effectiveness of CMOS-SPAD-technique on fluorescence suppression for solid drugs and solutions. Secondary goals were to collect knowledge on the similarities and differences between the Raman setups used for solution measurements, to optimize and discuss the key elements of setups for solids and solutions and to show preliminarily the applicability of the CMOS-SPAD-system on fluorescent drug's solutions as well as find out the requirements related to quantitative assessments using Raman spectroscopy. In drug research there is also constant need for reliable in vitro cell assays. The assessments made in this study may prove useful to the future applications e.g. measurements with living cells. An effective fluorescence suppression was achieved to strong fluorescent backgrounds using the novel time-resolved CMOS-SPAD-detection system coupled with the pulsed picosecond 532 nm laser. The setup is potentially a convenient tool to overcome many fluorescence-related limitations of Raman spectroscopy for laboratory and process analytical technology (PAT) use in the pharmaceutical setting. The results achieved encourage to consider that with careful calibration and method validation there is potential for quantitative analysis, biopharmaceutical and biological applications e.g. in vitro cell studies where most Raman techniques suffer from strong fluorescence backgrounds. Other potential fields for future applications can be also considered.Raman-spektroskopia on aineen rakenneosien värähtelyjen tutkimukseen käytettävä menetelmä. Aineen rakenteellinen kokonaisenergia muodostuu elektronisesta energiasta sekä vibraatio-, rotaatio- ja translaatioenergiasta. Näistä ennen kaikkea Raman-tekniikan kannalta keskeisiä ovat vibraatio- ja rotaatioenergiat esimerkiksi molekyyleissä. Raman-spektroskopiassa käytetään yleensä näkyvän valon ja lähi-infrapuna-alueen heräte-energiaa, joka kohdistetaan tutkittavaan näytteeseen. Näytteen rakenteeseen absorboituu heräte-energiaa, ja sitä siroaa elastisesti tai epäelastisesti takaisin kaikkiin mahdollisiin suuntiin. Elastinen sironta on Rayleigh-sirontaa, jolloin takaisin sironneiden fotonien energia on yhtä suuri kuin alkuperäinen heräte-energia. Epäelastinen sironta on Raman-sirontaa. Ilmiö on paljon harvinaisempi kuin elastinen sironta. Emittoituvat fotonit voivat olla energialtaan pienempiä (Stokes-sironta) tai suurempia (anti-Stokes) kuin alkuperäinen heräte-energia. Raman-spektrissä näkyvät spekrivyöt ja -piikit muodostuvat takaisin emittoituneiden fotonien energioiden (aaltolukujen) ja intensiteettien perusteella. Raman-spektroskopia antaa hyvin tarkkaa rakenteellista informaatiota tutkittavista molekyyleistä, se on käytännössä leima-ainevapaa tekniikka ja esimerkiksi mittaukset pakkausmateriaalien läpi onnistuvat. Näytteiden korkea vesipitoisuus ei haittaa spektrin muodostumista, jolloin Raman-tekniikkaa voidaan hyödyntää myös liuosnäytteille ja biologisille näytteille. Toisinaan ongelmaksi muodostuu kuitenkin luminesenssi-ilmiöt, kuten fluoresenssi. Fluoresenssi saattaa peittää alleen lähes samanaikaisesti tapahtuvan heikon Raman-signaalin. Esimerkiksi monilla lääkeaineilla on voimakkaasti fluoresoivia rakenteita ja tästä johtuen Raman-tekniikan käyttö lääkeainetutkimuksessa on osin rajoittunutta. Raman-signaalien vahvistamiseksi on kehitetty erilaisia menetelmiä. Voidaan hyödyntää esimerkiksi resonanssi-ilmiöitä tai SERS-tekniikkaa. Fluoresenssiin liittyvien ongelmien ratkaisuina on käytetty muun muassa pidemmän aallonpituuden laseria, näytteen valkaisua tai erityyppisiä signaalinkäsittelykeinoja fluoresenssitaustan poistamiseksi spektridatasta. Menetelmien haittana on kuitenkin ollut hitaus, kompleksisuus ja tehottomuus. Uudempaa tekniikkaa edustaa pikosekuntiluokan pulssilaser-herätteen käyttö sekä laserin kanssa tarkasti synkronoitu, ohjelmoitavalla viiveajalla toimiva CMOS-SPAD-detektoritekniikka. CMOS-SPAD-detektori mahdollistaa fotonien detektoinnin niiden intensiteetin ja energian mukaan sekä aikatasossa tapahtuvan detektoinnin. Raman-sironta ja fluoresenssi-ilmiöt tapahtuvat usein hieman eriaikaisesti, Raman alle pikosekunneissa ja fluoresenssi ~ nanosekunneissa. Näin ollen aika-erotteisella detektoinnilla ilmiöt voidaan erotella ja vähentää tehokkaasti fluoresenssin vaikutusta. Tämän tutkimuksen kirjallisuuskatsauksessa esitellään vibraatiospektroskopiaa, erityisesti Raman-spektroskopiaa. Katsauksessa käsitellään Raman-spektroskopian tekniikkaa, esitellään aika-erotteista Raman-tekniikkaa ja erityyppisiä Raman-spektroskopian sovelluksia lääkeaineiden sekä biomolekyylien tutkimuksessa. Tutkimuksen kokeellisessa osiossa oli tarkoituksena vertailla 785 nm jatkuvan aallonpituuden laserin ja CCD-detektorin yhdistelmää aika-erotteiseen 532 nm pulssilaseriin ja CMOS-SPAD-detektoriin erityyppisten lääkeaineiden mittauksissa. Tavoitteena oli saada kiinteiden lääkeaineiden ja niiden liuosten avulla tietoa aika-erotteisen laitteiston fluoresenssisuppression toimivuudesta. Lisäksi haluttiin selvittää alustavasti laitteistojen yhtenevyyksiä ja eroja lääkeaineliuosten mittauksissa ja optimoida kokoonpanoja kiinteiden lääkeaineiden sekä liuosten mittauksiin. Pyritiin osoittamaan uuden tekniikan soveltuvuus myös fluoresoivien lääkeaineliuosten mittauksiin ja selvittämään kvantitatiivisten mittausten asettamia vaatimuksia Raman-spektroskopialle. Lääkeainetutkimuksessa ovat usein kiinnostuksen kohteena myös in vitro suoritettavat solumääritykset. Näin ollen tutkimuksessa luotiin edellä esitettyjen määritysten avulla myös pohjaa elävillä soluilla tehtäviä mittauksia varten. Aika-erotteista Raman-spektroskopiaa käyttämällä onnistuttiin tehokkaasti vähentämään fluoresenssia niilläkin lääkeaineilla, joiden Raman-spektrin mittaus 785 nm herätteellä oli käytännössä mahdotonta. CMOS-SPAD-kokoonpanon todettiin olevan käyttökelpoinen työväline Raman-mittauksiin liittyvien fluoresenssiongelmien vähentämiseksi farmaseuttisissa sovelluksissa laboratorio-olosuhteissa sekä esimerkiksi prosessianalyysiteknologiassa (PAT). Lisäksi saatiin rohkaisevia tuloksia siitä, että tarkalla laitteiston kalibroinnilla ja menetelmien validoinnilla voidaan jatkossa suorittaa myös kvantitatiivista analyysiä ja mittauksia biologisille näytteille.
Subject: Raman
NIR
CMOS
SPAD
spectroscopy
time-resolved
drug
fluorescence
pulse
picosecond
spektroskopia
aika-erotteinen
lääkeaine
fluoresenssi
pulssi
laser
pikosekunti


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
Tatu_Rojalin_Gradu_Final_6.pdf 5.734Mb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record