Alternative sigma factors F, E, G, and K in Clostridium botulinum sporulation and stress response

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-51-0546-2
Title: Alternative sigma factors F, E, G, and K in Clostridium botulinum sporulation and stress response
Author: Kirk, David
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Veterinary Medicine, Department of Food Hygiene and Environmental Health
Publisher: Helsingin yliopisto
Date: 2015-01-30
URI: http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-51-0546-2
http://hdl.handle.net/10138/152840
Thesis level: Doctoral dissertation (article-based)
Abstract: Clostridium botulinum presents a risk to food safety through the production of endospores. These spores are highly heat-resistant and may withstand temperatures used in food processing. Despite this, the process of spore formation is poorly understood in C. botulinum. This study aimed to analyse in Group I C. botulinum ATCC 3502 the role of sigma (σ) factors σF, σE, σG, and σK. The role of these σ factors is well known in other spore formers, activating in an ordered cascade to regulate gene transcription during sporulation. To study gene expression during sporulation in C. botulinum ATCC 3502, we identified a suitable normalisation reference gene for reverse-transcription real-time PCR (RT-qPCR). Mutants of sigF, sigE, sigG, and sigK were examined on the transcriptional level during sporulation, and each strain was characterised for growth and spore formation. Furthermore, the role of σK in stress tolerance was investigated under cold, NaCl, and pH stresses. Transcriptional analysis, from exponential to stationary phases of growth, of eight candidate reference genes was performed. The candidate genes were 16S ribosomal RNA (rrn), the ATP metabolism enzymes adenosine kinase (adK) and glutamate dehydrogenase (gluD), the DNA-binding protein gyrase (gyrA), and ribosome-related proteins alanyl-tRNA synthetase (alaS), GTP-binding Era (era), RNA polymerase β subunit (rpoC) and 30S ribosomal protein S10 (rpsJ). Of these candidates, only 16S rrn was stable during the study period. 16S rrn was used as the normalisation reference gene for RT-qPCR analysis of spo0A, sigF, sigE, sigG, and sigK expression during the same growth period. Expression of spo0A was highest during exponential growth, suggesting a role in early sporulation. Induction of sigF, sigE, and sigG expression occurred on entry into stationary growth, indicating a role in sporulation. Expression of sigK appeared biphasic, being expressed in both exponential and stationary phases, suggesting σK may play a dual role in sporulation. The genes of σF, σE, σG, and σK were mutated using the ClosTron tool. RT-qPCR analysis of the sigF and sigE sense mutants suggested that the sporulation pathway was disrupted in the early stages. This was confirmed by electron microscopy, which showed that all sigF and sigE mutants were unable to form spores. They halted sporulation after asymmetric cell division, stage II of the seven-stage sporulation cycle. The sigG sense mutant showed delayed transcription of the sporulation pathway and both sigG mutants possessed a thin spore coat but no cortex. This indicated that σG may be responsible for cortex, but not coat, formation in C. botulinum. The sigK sense mutant did not express the early-sporulation genes spo0A and sigF. Both sigK mutants appeared to halt sporulation early. Sporulation was restored by complementing the sigK mutation in trans. These results suggested that σK plays an essential role in early sporulation of C. botulinum ATCC 3502, and adds further weight to the possibility of a dual role in sporulation overall in this strain. Expression of sigK was assessed in C. botulinum ATCC 3502 after cold, osmotic (NaCl), and acidic shock. After cold and osmotic shock, expression of sigK was induced. Both sense and antisense sigK mutants were then grown under stress conditions of low temperature, high NaCl, and low pH. Under low temperature and high NaCl conditions, but not in low pH, growth of the mutant strains was negatively affected compared to parent strain growth, suggesting that σK may play a role in tolerance to low temperature and high salinity stress conditions.Clostridium botulinum bakteeri muodostaa itiöitä, jotka uhkaavat elintarviketurvallisuutta. Itiöt ovat erittäin kestäviä ääriolosuhteille ja ne kestävät muun muassa monia elintarviketeollisuuden lämpökäsittelyitä. Tässä tutkimuksessa selvitettiin itiöimistä muilla bakteerilajeilla säätelevien σF-, σE-, σG- ja σK-sigmatekijöiden toimintaa ja merkitystä C. botulinum ATCC 3502 -bakteerikannalla. Työssä kehitettiin ensin C. botulinumin geeni-ilmentymisen mittaamiseen soveltuva reaaliaikainen PCR-menetelmä (RT-qPCR) ja tunnistettiin menetelmän käyttöön sopiva vertailugeeni. Menetelmän avulla tutkittiin kyseisiä sigmatekijöitä koodaavien geenien (sigF, sigE, sigG ja sigK) toimintaa bakteerin kasvun ja itiöimisen aikana. sigF-, sigE-, sigG- ja sigK-geenit mutatoitiin yksitellen ja kunkin mutanttikannan itiöitymistä ja geeni-ilmentymistä tutkittiin ja verrattiin villityypin kannan vastaaviin. Lisäksi työssä selvitettiin σK-tekijän merkitystä ATCC 3502 -kannan stressinsiedossa. Kahdeksan vertailugeenikandidaatin joukosta ainoastaan ribosomaalista RNA:ta koodaava 16S rrn osoittautui RT-qPCR-testiin soveltuvaksi sen tasaisen ilmentymisen takia. Menetelmän avulla tutkittiin itiöimisen aloittamisesta vastaavaa Spo0A-tekijää koodaavan spo0A-geenin sekä sigF-, sigE-, sigG- ja sigK-geenien ilmentymistä ATCC 3502 kannan kasvun ja itiöimisen aikana. spo0A-geenin ilmentyminen oli odotetusti huipussaan vielä aktiivisen solunjakautumisen aikana, joten sillä oletettiin olevan itiöimisen alulle paneva vaikutus myös C. botulinumilla. sigF-, sigE- ja sigG-geenit aktivoituivat bakteerikannan kasvun hidastuessa, mikä viittaa keskeiseen rooliin bakteerin itiömuodostuksessa. sigK-geenillä havaittiin kaksivaiheinen ilmentymisprofiili, mikä viittaa kaksijakoiseen rooliin itiöimisen säätelyssä. Mutaatioanalyysissa sigF- ja sigE-geenien suhteen mutatoitujen kantojen itiöitymisen todettiin pysähtyneen aikaisessa vaiheessa (ns. II vaihe, jolle on tyypillistä asymmetrinen solunjakautuminen mutta ei vielä itiörakenteiden muodostuminen) sekä RT-qPCR-testin että elektronimikroskopian avulla. sigG-geenin suhteen mutatoitu kanta taas ilmensi muita itiöitymiseen liittyviä geenejä kontrollikantaa hitaammin, mutta muodosti ohuen itiökuoren mutta ei tyypillistä vaippakerrosta. Tuloksen perusteella σG-tekijä osallistuu C. botulinumilla lähinnä itiövaipan muodostumisen säätelyyn. sigK-geenin suhteen mutatoitu kanta ei ilmentänyt spo0A- ja sigF-geenejä lainkaan eikä muodostanut itiöitä. Itiömuodostus saatiin palautettua tuomalla mutanttikantaan ylimääräinen sigK-geenikopio, mikä vahvistaa mutaatioanalyysin tulosten luotettavuuden. Tulokset viittaavat σK-tekijän merkitykseen aikaisessa itiömuodostuksen vaiheessa C. botulinum ATCC 3502 -kannalla, mikä poikkeaa itiöitymistutkimuksissa käytetystä Bacillus subtilis mallikannasta. sigK-geenin ilmentymistä tutkittiin lisäksi C. botulinum ATCC 3502 kannassa erilaisissa elintarvikkeiden säilytykselle tyypillisissä stressiolosuhteissa, kuten kylmässä, korkeassa suolapitoisuudessa, ja happamuudessa. sigK-geeni aktivoitui erityisesti kylmä- ja suolastressissä. Odotetusti sigK-geenin suhteen mutatoidut bakteerit kasvoivat kontrollikantaa heikommin niin ikään kylmä- ja suolastressissä. Tulokset osoittavat, että itiöitymisen lisäksi σK-tekijällä on keskeinen merkitys C. botulinum ATCC 3502 kannan stressinsietokyvyssä.
Subject: food hygiene
Rights: This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
alternat.pdf 1.273Mb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record