Development of liquid chromatography mass spectrometric methods for quantification of metabolites from cellular level to clinical biomarkers

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-51-0955-2
Title: Development of liquid chromatography mass spectrometric methods for quantification of metabolites from cellular level to clinical biomarkers
Author: Tohmola, Niina
Contributor organization: University of Helsinki, Faculty of Medicine, Haartman Institute
Helsinki University Central Hospital, Hospital District of Helsinki and Uusimaa, Laboratory services, HUSLAB
Helsingin yliopisto, lääketieteellinen tiedekunta, kliinisteoreettinen laitos
Helsingfors universitet, medicinska fakulteten, Haartman institutet
Publisher: Helsingin yliopisto
Date: 2015-04-24
Language: eng
URI: http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-51-0955-2
http://hdl.handle.net/10138/153950
Thesis level: Doctoral dissertation (article-based)
Abstract: Metabolites are low molecular weight compounds participating in different functions of cellular systems. Metabolites can be used as diagnostic biomarkers for numerous diseases. Liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) is a powerful tool in quantification of metabolites from various sample matrices. Good sensitivity and specificity are the main benefits of the technique. Mass spectrometry is commonly used in industry, drug research and clinical diagnostics. Extensive validation of newly developed analytical methods will construct the basis to a reliable assay, and it is significant especially when analysing e.g. patient samples. The aim of this study was to develop quantitative assays for metabolites from biological samples for biomedical research and clinical diagnostics. We designed and constructed an on-line high performance liquid chromatography (HPLC) equipment and validated an assay for direct quantification of extracellular metabolites from cell cultivation. Automated sampling for LC-MS/MS analysis of intracellular metabolites was connected to the on-line system. The on-line analysis improves the methodology and shortens the time of analysis. Furthermore, a frequent sampling data can provide valuable information about physiological indications in various cell cultivations. On-line HPLC is suitable for various biotechnological applications because of its ability to monitor and collect data during cell cultivation. We developed and validated LC-MS/MS assays for neuroendocrine tumor (NET) biomarkers 5-hydroxyindole acetic acid (5-HIAA) and vanillylmandelic acid (VMA) from human serum. Generally, urinary HPLC assays are used for the determination of NET markers. HPLC assays have certain limitations and 24-h urine collection is laborious. Our LC-MS/MS assays are specific, fast and well suited for diagnostics of NETs. Furthermore, guidelines for urine collection advise to refrain from serotonin-containing foods for three days before sample collection. We showed that such a diet restriction before serum 5-HIAA assay is not necessary. Instead, one day serotonin-free diet before sampling is sufficient because the half-life of 5-HIAA in circulation was found to be 1.3 hours. All assays developed during this study were sensitive and had a wide linear range. Our serum 5-HIAA LC-MS/MS assay is routinely used for the analysis of NET patient samples at the Helsinki University Central Hospital Laboratory, HUSLAB. Serum VMA LC-MS/MS assay will be in routine use in the HUSLAB in near future. Furthermore, On-line HPLC Ltd, (Helsinki, Finland) has commercialized the on-line HPLC equipment developed in this study.Metaboliitit ovat pienen molekyylipainon omaavia yhdisteitä, jotka osallistuvat erilaisiin toimintoihin solujen aineenvaihdunnassa. Eri metaboliitit toimivat myös useiden sairauksien merkkiaineina ja niiden pitoisuuden mittausta käytetään apuna sairauksien toteamisessa sekä seurannassa. Nestekromatografia (LC) yhdistettynä massaspektrometriaan (MS) on tehokas analyysitekniikka metaboliittien määritykseen. LC-MS -menetelmiä käytetään laajalti esimerkiksi teollisuudessa, lääketutkimuksessa sekä kliinisessä diagnostiikassa. Menetelmän validointi eli toimivuuden testaus on erittäin tärkeä vaihe uusien määritysmenetelmien kehityksessä. Validointi takaa, että menetelmä toimii halutulla tavalla ja että analyysitulokset ovat luotettavia, mikä on erityisen tärkeää varsinkin analysoitaessa potilasnäytteitä. Tämän työn tarkoituksena oli kehittää ja validoida kvantitatiivisia määritysmenetelmiä metaboliiteille käyttäen hyödyksi LC-MS -tekniikoita. Kyseisiä menetelmiä voidaan hyödyntää biolääketieteellisessä tutkimuksessa ja kliinisessä diagnostiikassa. Suunnittelimme ja valmistimme korkean erotuskyvyn nestekromatografia (HPLC) -laitteiston ja validoimme menetelmän solunulkoisten metaboliittien reaaliaikaiseen määritykseen suoraan solukasvatuksesta. Lisäksi keräsimme näytteitä solukasvatuksesta automaattisella näytteenottolaitteistolla ja määritimme kerätyistä näytteistä solun sisäisiä metaboliitteja LC-MS/MS -menetelmällä. Reaaliaikaisen mittauksen avulla saatiin lisää hyödyllistä tietoa solujen aineenvaihdunnasta. Metaboliitit 5-hydroksyyli-indoliasetaatti (5-HIAA) ja metoksihydroksimandelaatti (MOMA, VMA) ovat neuroendokriinisten kasvaimien merkkiaineita. Yleensä näitä merkkiaineita on määritetty potilaan vuorokausivirtsasta HPLC -menetelmällä yhdistettynä elektrokemialliseen tai flurometriseen detektioon. Nämä menetelmät ovat kuitenkin alttiita häiritseville yhdisteille, kuten lääkeaineille tai toisille metaboliiteille. Lisäksi vuorokausivirtsan keräys ja esikäsittely on hankalaa ja aikaa vievää sekä potilaalle että laboratoriolle. Näiden syiden vuoksi kehitimme ja validoimme suoraviivaiset LC-MS/MS -menetelmät 5-HIAA:n ja VMA:n nopeampaan ja luotettavampaan määritykseen verinäytteestä. Kehitetyt menetelmät ovat spesifisiä, nopeita ja sopivat hyvin kliiniseen diagnostiikkaan. Aiemmat potilasohjeet neuvoivat välttämään tiettyjä ruoka-aineita kolme päivää ennen 5-HIAA virtsanäytteenottoa. Me osoitimme, että yksi päivä riittää kyseisten ruoka-aineiden välttämiseen ennen verinäytteenottoa. Kaikki tässä työssä kehitetyt määritysmenetelmät olivat herkkiä, nopeita sekä paransivat analytiikkaa. Seerumin 5-HIAA -menetelmä on ollut rutiinikäytössä Helsingin yliopistollisen keskussairaalan laboratoriossa, HUSLAB:ssa vuodesta 2013 ja seerumin VMA -menetelmä otetaan käyttöön lähiaikoina. Lisäksi On-line HPLC -niminen yritys on kaupallistanut tässä työssä kehitetyn HPLC-laitteiston.
Subject: kliininen kemia
Rights: Julkaisu on tekijänoikeussäännösten alainen. Teosta voi lukea ja tulostaa henkilökohtaista käyttöä varten. Käyttö kaupallisiin tarkoituksiin on kielletty.


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
Thesis Niina Tohmola.pdf 1003.Kb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record