Hepatiitti C -viruksen genotyypitys sekvensointiin perustuvalla menetelmällä : Potilasdiagnostiikkaan soveltuvan menetelmän pystyttäminen

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-201508103463
Title: Hepatiitti C -viruksen genotyypitys sekvensointiin perustuvalla menetelmällä : Potilasdiagnostiikkaan soveltuvan menetelmän pystyttäminen
Author: Virtanen, Elina
Other contributor: Helsingin yliopisto, Maatalous-metsätieteellinen tiedekunta, Elintarvike- ja ympäristötieteiden laitos
University of Helsinki, Faculty of Agriculture and Forestry, Department of Food and Environmental Sciences
Helsingfors universitet, Agrikultur- och forstvetenskapliga fakulteten, Institutionen för livsmedels- och miljövetenskaper
Publisher: Helsingfors universitet
Date: 2014
Language: fin
URI: http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-201508103463
http://hdl.handle.net/10138/156096
Thesis level: master's thesis
Discipline: Mikrobiologi
Microbiology
Mikrobiologia
Abstract: Hepatiitti C -virus (HCV) on maailmanlaajuisesti merkittävä maksatautien aiheuttaja. Veriteitse tarttuva virus on infektoinut jo 170 miljoonaa ihmistä maailmassa ja siitä on tullut myös Suomessa merkittävä kroonisen maksatulehduksen aiheuttaja. Hepatiitti C -virukset ovat hyvin heterogeeninen virusjoukko, joka jaetaan sekvenssin perusteella numeroin 1–7 nimettyihin päägenotyyppeihin ja pienin kirjaimin nimettyihin alatyyppeihin. HCV-infektiota voidaan hoitaa lääkkein, ja käytettävään hoitoon sekä hoidon onnistumiseen vaikuttaa merkittävästi potilaan kantaman viruksen genotyyppi. Tämän tutkielman tavoitteena oli pystyttää uusi, sekvensointiin perustuva genotyypitysmenetelmä Helsingin ja Uudenmaan sairaanhoitopiirin laboratorion (HUSLAB) virologian ja immunologian osastolle. Tutkimuksessa keskityttiin diagnostiseen työnkulkuun soveltuvan, vakaan ja toistettavan menetelmän pystyttämiseen. Näytemateriaalina käytettiin HUSLABin aikaisemmassa HCV-genotyypitysdiagnostiikassa analysoituja näytteitä. Monistamista yritettiin useilla eri alukeyhdistelmillä HCV-genomin 5’UTR-, core/E1- ja NS5B-alueilta, joista 5’UTR osoittautui tavoitteet huomioon ottaen ainoaksi toimivaksi vaihtoehdoksi. Monistustuotteet sekvensoitiin käyttäen Sanger-menetelmää. Toissijaisena tavoitteena haluttiin yrittää koko HCV-genomin monistamista 454-syväsekvensointia varten mahdollisten sekainfektioiden ja lääkeaineresistenssimuutosten kartoittamiseksi. Tutkielman puitteissa onnistuttiin pystyttämään HCV-genomin 5’UTR-alueeseen ja Sanger-sekvensointiin perustuva vakaa ja luotettava genotyypitysmenetelmä HUSLABin virologian ja immunologian osaston kliiniseen potilasdiagnostiikkaan. Pystytetty menetelmä on ensimmäinen täysin sekvensointiin perustuva virologisen potilasdiagnostiikan menetelmä Suomessa. Kliinisen diagnostiikan työnkulun asettamissa puitteissa tutkielman toissijaisessa tavoitteessa, koko HCV-genomin monistamisessa ei onnistuttu. Asetetut vaatimukset ja rajoitukset huomioon ottaen voidaan todeta, että syväsekvensoinnin hyödyntäminen kliinisen potilasdiagnostiikan HCV-genotyypityksessä ei ainakaan vielä toistaiseksi ole mahdollista.Hepatitis C virus (HCV) is a globally significant blood-borne agent causing liver diseases. HCV has infected over 170 million people worldwide and it has become a significant causative agent of chronic liver inflammation also in Finland. HCV is a very diverse group of viruses that is divided into genotypes 1–7 as well as subtypes. HCV infection can be treated with antiviral drugs, and the drug of choice as well as treatment success are determined by the HCV genotype that the patient is carrying. The aim of this study was to develop a new, sequencing based HCV genotyping method for the Laboratory of the Hospital District of Helsinki and Uusimaa (HUSLAB), at the Department of Virology and Immunology. The focus of the study was to establish a steady and robust genotyping method that would be suitable for the workflow in clinical diagnostics. The samples used in this study had been previously analysed in regular HCV genotyping diagnostics at HUSLAB. The genomic regions chosen for amplification with several different primer options were 5’UTR, core/E1 and NS5B. 5’UTR turned out to be the only suitable option for the diagnostic workflow. The amplification products were sequenced using Sanger method. Amplification of the whole HCV genome in several different reaction conditions for 454 deep sequencing was also attempted to obtain information about possible mixed infections and drug resistance changes in the genome. In this study, a new HCV genotyping method based on Sanger sequencing of the 5’UTR region was successfully established. The method is robust, stable and suitable for the use in clinical diagnostics. The established HCV genotyping method is the first entirely sequencing-based method in clinical viral diagnostics in Finland. The secondary aim, amplification of the whole HCV genome using a method suitable for the workflow of clinical diagnostics was not achieved. Given the demands and restrictions of the workflow of clinical diagnostics we can conclude that routine HCV genotyping with deep sequencing methods is for the present not yet possible.
Subject: Hepatiitti C
HCV
genotyyppi
core/E1
NS5B
PCR
Sanger-sekvensointi
5'UTR


Files in this item

Files Size Format View

There are no files associated with this item.

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record