Anatoxin-a and odorous metabolites in cyanobacteria : molecular detection of the producers

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-51-1509-6
Title: Anatoxin-a and odorous metabolites in cyanobacteria : molecular detection of the producers
Author: Suurnäkki, Suvi
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Agriculture and Forestry, Department of Food and Environmental Sciences, Division of Microbiology and Biotechnology
Publisher: Helsingin yliopisto
Date: 2015-09-25
Language: en
Belongs to series: URN:ISSN:2342-5431
URI: http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-51-1509-6
http://hdl.handle.net/10138/156512
Thesis level: Doctoral dissertation (article-based)
Abstract: Cyanobacteria produce variety of secondary metabolites that may be toxic or cause odor problems in water environments. Taste and odor problems occur worldwide in freshwater, drinking water, and in the fish industry. Cyanobacterial mass occurrences pose a threat to users of water due to hepatotoxic or neurotoxic strains. Toxins are also a risk to recreational water use and have caused number of animal poisonings. Anatoxin-a and homoanatoxin-a are alkaloid neurotoxins produced by strains of several cyanobacterial genera. Cyanobacteria also produce strong odorous metabolites that cause musty and/or earthy odor and taste in water. The best known of these odorous metabolites are geosmin and 2-methylisoborneol (MIB). These odorous metabolites cause problems in extremely low concentrations due to the very low odor threshold of humans. Producers of bioactive metabolites and non-producing strains can occur in the same species and thus cannot be distinguished morphologically by microscopy techniques. The aims of this study were: I) to identify the ana gene cluster responsible for the biosynthesis of anatoxin-a from the strain Anabaena sp. 37; II) to develop molecular detection methods (PCR, quantitative PCR, restriction fragment length polymorphism RFLP) for the detection of potential anatoxin-a and homoanatoxin-a producers, and apply methods to environmental samples; and III) to develop a PCR-based molecular method for the detection of the producers of geosmin and MIB in cyanobacteria. Of the genomic sequence of Anabaena sp. 37, the gene cluster responsible for anatoxin-a biosynthesis (ana) was identified based on the comparison to the gene cluster from cyanobacteria Oscillatoria sp. PCC 6506. While the organization of the genes differed, the anatoxin-a synthetase genes were highly similar with Oscillatoria sp. PCC 6506 genes. PCR and qPCR detection methods were developed for anatoxin-a producing cyanobacteria. General primers were used to identify all the producer genera at the same time and genus-specific primers for Anabaena or Oscillatoria producers. Primers were designed to recognize the anaC gene and tested with anatoxin-a and/or homoanatoxin-a producing strains in PCR and qPCR. In addition, RFLP analysis of the anaC amplicons was used to simultaneously identify three anatoxin-a producer genera Anabaena, Oscillatoria, and Aphanizomenon. Molecular methods for anatoxin-a producers were also applied to environmental samples. With developed PCR and RFLP methods, the presence of Anabaena and Oscillatoria as potential anatoxin-a producers in Finnish freshwaters and the Baltic Sea was observed. The developed qPCR method was used to quantify the anaC gene copy numbers in Lake Garda during February-November 2013. The gene copy numbers correlated positively with the anatoxin-a concentration measured in lake samples. Thus, the developed method could be used for the detection of potential anatoxin-a and homoanatoxin-a producers in cyanobacterial strains and to predict the amount of anatoxin-a producers from lake water samples. A hundred cyanobacterial strains were studied with solid-phase microextraction coupled with gas chromatography/mass spectrometry (SPME GC-MS) in order to identify the producers of geosmin and MIB. Geosmin was found in 21 strains out of the 100 studied, representing Nostoc, Oscillatoria, Calothrix, Planktothrix, Aphanizomenon, and Cylindrospermum genera. MIB was found in two strains, Planktothrix and Oscillatoria, both also producing geosmin. Cyanobacteria-specific primers were designed to detect biosynthetic genes of geosmin (geoA) and MIB (MIB synthase) and tested with the odorous metabolite-producing strains. Molecular detection by PCR was consistent with chemical detection by SPME GC-MS. Molecular detection methods developed in this study to detect anatoxin-a or odorous metabolites producing strains could be used in surveys to identify possible producers among cyanobacterial strains and in environmental samples.Syanobakteerit tuottavat useita erilaisia sekundaarimetabolian tuotteita. Nämä yhdisteet saattavat olla myrkyllisiä ja aiheuttaa maku- ja hajuhaittoja vesistöissä. Näiden yhdisteiden aiheuttamia maku- ja hajuhaittoja esiintyy maailmanlaajuisesti juomavesissä ja kaloissa. Syanobakteerien massaesiintymät aiheuttavat riskin juomaveden käytölle hepatotoksisten ja neurotoksisten syanobakteerien vuoksi. Syanobakteerien tuottamat myrkyt haittaavat veden virkistyskäyttöä ja ne ovat myös aiheuttaneet useita eläinkuolemia. Anatoksiini-a ja homoanatoksiini-a ovat neurotoksiineja, joita tuottavat useat eri syanobakteerien suvut ja lajit. Syanobakteerien tuottamat voimakkaat maku- ja hajuaineet aiheuttavat mudan/maan maun ja hajun veteen. Parhaiten tunnettuja hajumetaboliitteja ovat geosmiini ja 2-metyyli-isoborneoli. Nämä hajumetaboliitit aiheuttavat ongelmia jo hyvin pieninä pitoisuuksina. Hajumetaboliittien ja toksisten yhdisteiden tuottajia ei voi erottaa niitä tuottamattomista saman lajin kannoista mikroskopoinnilla. Työn tavoitteena oli identifioida anatoksiini-a:n tuotosta vastaava ana geenijoukko Anabaena sp. 37 -kannasta. Lisäksi tarkoitus oli kehittää molekuularisia havainnointimenetelmiä (PCR, qPCR, katkokirjoanalyysi RFLP) anatoksiini-a:n tuottajien tunnistamiseksi ja soveltaa niitä luonnonvesinäytteisiin. Myös geosmiinin ja 2-metyyli-isoborneolin tuottajien havainnointiin syanobakteereista kehitettiin PCR-pohjainen osoitusmenetelmä. Anabaena sp. 37 -kannan genomisekvenssistä identifioitiin ana-geenijoukko vertailemalla sitä Oscillatoria sp. PCC 6506 kannan ana-geenijoukkoon. Vertailussa havaittiin, että geenien organisaatio biosynteesigeenijoukossa on erilainen, mutta Anabaena-kannan anatoksiini-a syntetaasigeenit ovat hyvin samankaltaiset Oscillatoria-kannan kanssa sekvenssitasolla. PCR- ja qPCR-menetelmät kehitettiin anatoksiini-a:n tuottajien havainnoimiseksi. Yleiset alukkeet suunniteltiin tunnistamaan tuottajia kaikista tuottajasuvuista samanaikaisesti ja sukuspesifiset alukkeet tunnistamaan Anabaena- ja Oscillatoria-sukujen tuottajat erikseen. Alukkeet suunniteltiin osoittamaan anaC-geeniä ja niiden toimivuus testattiin anatoksiini-a:n ja homoanatoksiini-a:n tuottajakannoilla. Lisäksi RFLP-menetelmä kehitettiin tunnistamaan yhtä aikaa kolmen eri tuottajasuvun anaC-geeniä, Anabaena, Aphanizomenon ja Oscillatoria. Kehitettyjä molekulaarisia menetelmiä sovellettiin luonnonvesinäytteisiin ja Anabaena sekä Oscillatoria havaittiin mahdollisina anatoksiini-a:n tuottajina suomalaisissa järvivesissä ja Itämeressä. Kehitetyn qPCR-menetelmän avulla kvantitoitiin anaC-geenikopiolukumääriä Italian Garda-järvestä helmi-marraskuussa vuonna 2013. Menetelmän avulla havaittiin, että geenikopiolukumäärät korreloivat positiivisesti järvinäytteiden anatoksiini-a:n konsentraation kanssa. Näin ollen tässä työssä kehitetyt menetelmät toimivat erinomaisesti mahdollisten anatoksiini-a:n ja homoanatoksiini-a:n tuottajien havainnoimiseksi syanobakteereista, ja niiden avulla voidaan arvioida anatoksiini-a:n tuottajien määrää luonnonvesinäytteissä. Sata syanobakteerikantaa tutkittiin kiinteäfaasimikrouutto ja kaasukromatografia -menetelmällä (SPME GC-MS), jotta voitiin tunnistaa geosmiinin ja 2-metyyli-isoborneolin tuottajia. Geosmiinin tuottajia löydettiin 21 kannasta ja kuudesta suvusta (Nostoc, Oscillatoria, Calothrix, Planktothrix, Aphanizomenon ja Cylindrospermum). 2-metyyli-isoborneolia löydettiin yhdestä Planktothrix- ja yhdestä Oscillatoria-kannasta. Molemmat 2-metyyli-isoborneolin tuottajat tuottivat myös geosmiinia. Syanobakteeri-spesifiset alukkeet suunniteltiin tunnistamaan geosmiini- ja 2-metyyli-isoborneolisyntaasi-geenit (geoA ja MIB syntaasi). Työssä kehitetyllä PCR-menetelmällä havaittiin kaikki kemiallisella menetelmällä tunnistetut hajumetaboliittien tuottajat. Tässä työssä kehitettyjä molekulaarisia havainnointimenetelmiä voidaan käyttää tutkittaessa anatoksiini-a:n ja hajumetaboliittien potentiaalisia tuottajia syanobakteerikannoista ja ympäristöstä.
Subject: mikrobiologia
Rights: This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
anatoxin.pdf 840.8Kb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record