Phagophore membrane connections and RAB24 in autophagy

Show full item record

Permalink

http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-51-1741-0
Title: Phagophore membrane connections and RAB24 in autophagy
Author: Ylä-Anttila, Päivi
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Biological and Environmental Sciences, Department of Biosciences, Biokemian ja biotekniikan osasto
Thesis level: Doctoral dissertation (article-based)
Belongs to series: URN:ISSN:2342-317X
Abstract: Eukaryotic cells contain membrane-bound organelles to carry out specialized cellular functions. These organelles are inherited in cell division as templates and are augmented by proliferation through production of protein and lipid components by the cell, and the trafficking of these components within the cell. Autophagy is an evolutionarily conserved degradation pathway for cells to maintain homeostasis, produce nutrients for energy production, degrade misfolded proteins or damaged whole organelles, and fight against intruding pathogens. The process of autophagy entails the isolation of cargo by a specialized organelle, called the phagophore, which closes to form a sealed double membrane bound autophagosome. This organelle then undergoes maturation by fusion with endosomes and lysosomes to obtain its degradation capacity. Hence, there are many dynamic membrane modifications that need to take place during the autophagic process. The origin of the autophagic limiting membrane, as well as the clearance of the degradative structures, are yet to be defined. This study utilized high resolution electron microscopic methods and three dimensional modeling to reveal nanometer scale interactions of phagophores and autophagosomes with other organelles. Immunolabeling techniques at both light and electron microscopy level were utilized to determine which organelles should be sampled at an ultrastructural level. Direct membrane communication was detected between the phagophore and endoplasmic reticulum (ER), (putative) ER exit sites, mitochondria, the Golgi complex, as well as late endosomes or lysosomes. ER was the most frequent proximal organelle to phagophores and autophagosomes and this suggests an involvement of ER in the nucleation process of phagophores. This study also reveales a role of the small GTP-binding protein RAB24 in the clearance of autophagic structures in cells. Biochemical and microscopic methods in combination showed that RAB24 is needed in the clearance of autophagic structures in nutrient rich conditions i.e. during basal autophagy. RAB24 was confirmed to localize in both of the autophagosome limiting membranes. GTP binding and prenylation of RAB24 were found to be necessary for the targeting of the protein to LC3 positive autophagic structures, whereas tyrosine phosphorylation was less important for this targeting. Electron microscopy revealed that autolysosome-like structures accumulate in cells when RAB24 is silenced, suggesting that it has a role in the clearance of autolysosomes.Aitotumalliset solut sisältävät monia erikoistuneita kalvon ympäröimiä osastoja eli soluelimiä tai organelleja, joissa solujen biologiset prosessit tapahtuvat. Soluelimet periytyvät solunjakautumisessa tytärsoluihin, ja solut voivat säädellä soluelimien kokoa ja lukumäärää tuottamalla niille ominaisia proteiineja ja lipidejä. Rakennusaineet kulkevat soluissa erityisiä kuljetusreittejä pitkin. Yhtä soluille tärkeää hajotusreittiä kutsutaan autofagiaksi, jonka avulla solut voivat kierrättää tarpeettomia ja vaurioituneita osiaan kuten proteiineja tai kokonaisia soluelimiä. Autofagia on myös tärkeä ravinteiden lähde energiantuotantoon, ja sen avulla solut voivat puolustautua solun sisälle päässeitä patogeenejä vastaan. Autofagiassa solu muodostaa erityisen soluelimen, fagoforin, joka eristää hajotettavan materiaalin ja kuroutuu suljetuksi vesikkeliksi. Tämä vesikkeli on kaksoiskalvon ympäröimä ja sitä kutsutaan autofagosomiksi. Autofagosomit kypsyvät yhtymällä endosomeihin ja lysosomeihin ja näin ollen hankkivat hajotukseen tarvittavat entsyymit ja entsyymeille tarvittavat suotuisat olosuhteet. Autofagian toimiminen edellyttää solulta toimivaa kalvokuljetusta ja monia kalvomodifikaatioita. Autofagosomin ympäröivän kalvon alkuperää ei vielä tunneta. Myöskään hajotuksen jälkeisiä tapahtumia, kuten autofagosomien häviämistä solusta, ei tarkoin tunneta. Tässä tutkimuksessa muodostuvaa fagoforia on tarkasteltu erittäin korkean resoluution elektronimikroskooppisilla menetelmillä yhdistettynä kolmiulotteiseen mallinnukseen. Näillä menetelmillä fagoforeja ja autofagosomeja on voitu tarkastella suhteessa muihin soluelimiin nanometrien tarkkuudella. Vasta-aineleimausta käytettiin sekä valo- että elektronimikroskopiassa soluelimien tunnistamiseen. Elektronitomografialla pystyttiin osoittamaan kalvokontakteja fagoforin ja monien muiden soluelinten välillä. Fagofori oli yhteydessä solulimakalvoston eri osiin, mitokondrioihin, Golgin laitteeseen ja myöhäisiin endosomeihin tai lysosomeihin. Muodostuvan fagoforin havaittin olevan myös lähellä lipidipisaraa. Useimmiten fagoforit löytyivät solulimakalvoston välittömästä läheisyydestä, mikä saattaa viitata solulimakalvoston toimintaan fagoforin muodostuksessa, esimerkiksi kalvon luovuttajana. Tässä tutkimuksessa myös osoitettiin, että pieni guaniininukleotidejä sitova proteiini, RAB24, toimii autofagosomien hävittämisessä soluista. RAB24 proteiinin osoitettiin toimivan autofagosomien hävittämisessä soluista ravinteikkaissa olosuhteissa hyväksikäyttäen mikroskooppisia ja biokemiallisia menetelmiä. RAB24:n osoitettiin paikantuvan autofagosomeja ympäröiville kalvoille. Lisäksi RAB24:n kohdentaminen autofagosomien kalvoille oli riippuvaista sen kyvystä sitoa guaniininukleotidejä sekä sen lipidiankkurista. Tyrosiiniaminohappotähteiden fosforylaatio ei ollut välttämätöntä RAB24:n kohdentamiselle autofagosomeihin. Elektronimikroskooppisin menetelmin pystyttiin osoittamaan, että RAB24:n puuttuminen aiheutti autofagosomien kerääntymisen soluihin. Tämä viittaa siihen, että RAB24 tarvitaan autofagosomien tehokkaaseen poistamiseen soluista.
URI: URN:ISBN:978-951-51-1741-0
http://hdl.handle.net/10138/157963
Date: 2015-12-04
Subject: biokemia
Rights: This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
phagopho.pdf 953.0Kb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record