Delivery of Oncolytic Adenovirus via Extracellular vesicles

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:NBN:fi-fe201801151338
Title: Delivery of Oncolytic Adenovirus via Extracellular vesicles
Author: Aksela, Laura
Other contributor: Helsingin yliopisto, Farmasian tiedekunta
University of Helsinki, Faculty of Pharmacy
Helsingfors universitet, Farmaceutiska fakulteten
Publisher: Helsingfors universitet
Date: 2016
Language: eng
URI: http://urn.fi/URN:NBN:fi-fe201801151338
http://hdl.handle.net/10138/167382
Thesis level: master's thesis
Discipline: Biofarmaci
Biopharmacy
Biofarmasia
Abstract: Even though cancer treatment modalities have improved during last decades, there is still lack of specific, efficient and curative treatments especially in case of advanced and metastatic cancers. One relatively new approach is to use oncolytic adenoviruses, which selectively infect and kill cancerous cells leaving healthy cells unharmed. These viruses have shown to be effective especially when administered intratumorally and in combination with chemotherapeutics. However this approach has multiple challenges like rapid clearance by antibody neutralization in systemic administration. Another challenge is the cell entry of oncolytic adenovirus, which is mainly mediated by the Coxsackie-Adenovirus receptor and this receptor is downregulated in various cancer cells. Rapid clearance and reduced cell entry thus lead to decreased amount of oncolytic adenovirus in target cells and decreased efficacy. In order to overcome these limitations, this study explored the possibility to use cancer cell derived extracellular vesicles (EVs) as drug delivery system for oncolytic adenovirus. Since oncolytic adenoviruses have shown to be effective especially in combination with chemotherapeutics, the ability of EVs to deliver both oncolytic adenoviruses and chemotherapeutic drug paclitaxel was studied. The aims of this study were to i) study whether oncolytic adenoviruses could be encapsulated inside EVs (EV-virus complex) and load this complex with paclitaxel (EV-virus-PTX complex), ii) discover whether the surface charge or size distribution of EV-virus and EV-virus-PTX complexes differs from the control EVs and iii) study the infectivity/efficacy of EV-virus and EV-virus-PTX complex in comparison to noncapsulated adenovirus in vitro. Since this is a novel approach, the literature review focused on the characteristics, advantages and challenges of oncolytic adenoviruses and EVs. In order to determine whether cancerous cell are able to encapsulate oncolytic adenoviruses inside EVs, A549 lung cancer and PC-3 prostate cancer cells were infected with oncolytic adenovirus and the formed EVs were isolated form conditioned media using differential centrifugation. Paclitaxel was loaded into these EV-virus complexes with incubation. EV-virus complexes were imaged using transmission electron microscopy (TEM) (i). The characteristics of these EV-virus and EV-virus-paclitaxel complexes were studied by determining the surface charge by electrophoretic light scattering and the size distribution by nanoparticle tracking analysis (ii). In order to determine the infectivity/efficacy of these complexes in autologous use, three in vitro level assays were performed (cell viability, immunocytochemistry and transduction assay) (iii). In addition confocal microscopy was used to observe the localization of EV-virus complexes inside the cell. These studies pointed out that both cell lines were able to encapsulate oncolytic adenovirus inside EVs, which was observed by TEM. The size distribution of these EV-virus and EV-virus-PTX complexes may support this observation and the size was in range 50-500 nm. In addition the determined surface charge was shown to be similar in EV-virus and EV-virus-PTX- complexes when compared to control EVs derived from noninfected cells - however more specific assays in order to characterize the surface properties of EV-virus complexes are needed. As a main finding, these EV-virus and EV-virus-PTX complexes were shown to significantly increase the efficacy of oncolytic adenovirus in comparison to free oncolytic adenovirus, paclitaxel and paclitaxel+virus combination in all three in vitro assays. In addition localization of the EV-virus complex was seen with confocal microscopy imaging. These results indicate that EVs may enhance the delivery of oncolytic adenovirus into cancerous cells. Using EVs as a drug delivery system for both oncolytic adenovirus and chemotherapeutic drug paclitaxel was shown to increase the efficacy of oncolytic adenovirus in comparison to free virus. This characteristic could potentially enhance the targeting ability to cancerous cells and thus lead to decreased amount of side-effects of healthy tissues especially in case of chemotherapeutics. These promising results of this novel approach are however preliminary due to relatively low number of repetitions (n~3) and more research is needed especially in order to characterize, purify and concentrate the EV-virus complexes.Vaikka viimeisten vuosikymmenien aikana syövän hoito on kehittynyt ja parantumisen todennäköisyys on parantunut merkittävästi, etenkin vaikeiden ja etäpesäkkeitä lähettäneiden syöpien hoidossa on yhä tarve uusille, spesifisemmille ja tehokkaammille hoitomuodoille. Yksi lähestymistapa on käyttää selektiivisesti syöpäsoluja tuhoavia, onkolyyttisiä adenoviruksia. Vaikka näiden adenoviruksien on osoitettu olevan tehokkaita ja turvallisia intratumoraalisesti annosteltuna etenkin yhdessä kemoterapian kanssa, haasteena on niiden annostelu verenkierron kautta. Verenkiertoon annosteltaessa veren vasta-aineet tunnistavat adenoviruksen, opsonisoivat sen ja poistavat sen ennen kuin virus on päässyt vaikutuskohtaansa heikentäen merkittävästi adenoviruksen tehoa. Toinen haaste on adenoviruksen pääsy syöpäsolun sisään, joka on pääsääntöisesti adenovirus- ja coxsackie virus - reseptorivälitteistä. Tämän reseptorin osuuden on havaittu vähentyneen eri syövissä, joka puolestaan laskee onkolyyttisen adenoviruksen soluun pääsyä ja täten sen tehoa. Tässä työssä on lähdetty tutkimaan mahdollisuutta käyttää syöpäsolun omia mikrovesikkeleitä onkolyyttisen adenoviruksen lääkekuljettimena käyttäen PC-3 eturauhassyöpä- ja A549 keuhkosyöpäsoluja. Lisäksi tutkittiin tämän virus-mikrovesikkeli-kompleksin lataamista solunsaljaapa paklitakselilla ja sen vaikutusta sytotoksiseen tehoon. Tutkimuksella haetaan vastauksia seuraaviin kysymyksiin: i) onko mahdollista pakata onkolyyttinen adenovirus sisään? ii) vaikuttaako adenoviruksen ja paklitakselin pakkaaminen mikrovesikkelin sisään mikrovesikkelin ominaisuuksiin? iii) parantaako adenoviruksen ja paklitakselin pakkaaminen mikrovesikkeliin niiden tehoa? Kirjallisuuskatsauksessa on käyty läpi sekä onkolyyttisten adenoviruksien että mikrovesikkelien ominaisuuksia, etuja ja haasteita. Itse tutkimuksessa onkolyyttinen adenovirus pakattiin mikrovesikkelin sisään infektoimalla PC-3 eturauhas- ja A549- keuhkosyöpäsoluja kyseisellä viruksella ja eristämällä näiden syöpäsolujen tuottamia mikrovesikkeleitä differentiaalisentrifugaatiolla. Paklitakseli ladattiin näihin vesikkelikomplekseihin inkuboimalla eristyksen jälkeen. Jotta nähtäisiin, onko onkolyyttinen adenovirus todella mikrovesikkelin sisällä (i) ja miten tämä kompleksi kulkeutuu solun sisällä, kuvannettiin näitä muodostuneita komplekseja sekä elektroni- että konfokaalimikroskopian avulla. Lisäksi mikrovesikkeli-adenovirus-kompleksien kokojakaumaa tutkittiin hyödyntäen nanopartikkelianalyysiä (NTA). Se, vaikuttaako adenoviruksen pakkaaminen mikrovesikkelin sisään itse pinnan ominaisuuksiin, tutkittiin mittaamalla mikrovesikkeleiden pinnan varausta (zetapotentiaali) käyttämällä dynaamista, elektroforeettista valonsirontamenetelmää. In vitro solukokeiden (viabiliteetti, transduktio ja immunosytotoksinen värjäys) avulla pyrittiin selvittämään, parantaako mikrovesikkeliin pakkaaminen adenoviruksen infektiivisyyttä (iii). Lisäksi tutkimme tuoko paklitakselin pakkaaminen tähän virus-vesikkelikompleksiin synergisiä etuja hoidon tehoon solutasolla. Tutkimuksien perusteella havaittiin, että molemmat syöpäsolulinjat pystyivät pakkaamaan adenoviruksen mikrovesikkelin sisään. Tämä todistettiin elektronimikroskooppi kuvien avulla, joissa nähtiin onkolyyttisen adenoviruksen olevan mikrovesikkelin sisällä. Tehdyt kokojakauman mittauksen tulokset saattavat tukea tätä havaintoa ja näiden vesikkelien koon havaittiin olevan 50-500 nm luokkaa, joskin lisätutkimuksia tarvitaan. Pinnan varauksen havaittiin myös säilyvän samalla tasolla kontrollina käytettyihin mikrovesikkeleihin verrattuna niin virus-mikrovesikkelikompleksissa kuin paklitakselilla ladatussa versiossa. Kaikki kolme in vitro solukoetta myös osoittivat, että onkolyyttisen adenoviruksen pakkaaminen mikrovesikkelin sisään parantaa sen onkolyyttistä tehoa verrattuna vapaaseen onkolyyttiseen adenovirukseen (p<0,05). Kun tähän kompleksiin lisättiin paklitakseli, tämän kompleksin havaittiin olevan merkittävästi sytotoksisempi verrattaessa vapaan viruksen ja paklitakselin yhdistelmään. Nämä tutkimustulokset osoittavat, että mikrovesikkelien hyödyntäminen onkolyyttisen adenoviruksen sekä paklitakselin lääkekuljettimena parantaa merkittävästi hoidon tehoa solutasolla mahdollisesti parantaen viruksen soluun pääsyä. Mikrovesikkelien käyttö lääkekuljettimena voi näin ollen parantaa terapeuttisten komponenttien kohdennusta syöpäsoluihin samalla vähentäen sivuvaikutuksia terveisiin soluihin. Tämän tutkimuksen tulokset ovat kuitenkin hyvin alustavia ja suuntaa antavia ja lisätutkimuksia tarvitaan etenkin näiden virus-mikrovesikkeli kompleksien karakterisoinnissa ja eristämisessä.
Subject: oncolytic adenovirus
extracellular vesicles
paclitaxel
cancer
onkolyyttinen adenovirus
mikrovesikkeli
paklitakseli
syöpä


Files in this item

Files Size Format View

There are no files associated with this item.

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record