Molecular mechanisms controlling neuronal Bak expression

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-51-2616-0
Title: Molecular mechanisms controlling neuronal Bak expression
Author: Jakobson, Maili
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Biological and Environmental Sciences, Department of Biosciences, Division of Physiology and Neuroscience
Institute of Biotechnology University of Helsinki
Doctoral Program in integrative Life Sciences University of Helsinki
Publisher: Helsingin yliopisto
Date: 2016-11-11
Language: en
Belongs to series: Dissertationes Scholae Doctoralis ad Sanitatem Investigandam Universitatis Helsinkiensis - URN:ISSN:2342-317X
URI: http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-51-2616-0
http://hdl.handle.net/10138/167495
Thesis level: Doctoral dissertation (article-based)
Abstract: Studies in the past three decades have provided a detailed understanding of the key mechanisms mediating apoptosis (a type of programmed cell death) in eukaryotic cells. Our knowledge of the molecular regulation of apoptotic factors is, however, incomplete.Recent evidence from genetic and molecular studies demonstrate that possibilities to activate cell death machinery in post-mitotic cells is more restricted than in most dividing cell types. The aim of our studies has been to better understand the unique features regulating apoptotic factors in neurons. Apoptosis in mammalian cells is controlled by Bcl-2 family proteins. Of those, the BH3-only subgroup and pro-apoptotic effectors Bak and Bax are particularly important in initiating apoptosis. In most types of neurons Bak expression is affected by an alternative splicing mechanism. Neuronal bak variant, N-Bak, encodes a putative BH3-only protein, but its existence has remained controversial. N-Bak mRNA is abundantly expressed, suggesting that post-transcriptional mechanisms may control N-Bak protein expression in neurons. This thesis addresses the molecular mechanisms, which regulate neuronal Bak expression in more detail. Using immunoblot analysis, we show that endogenous N-Bak protein is not constitutively expressed in healthy neurons. N-Bak protein expression remained undetectable upon nerve growth factor deprivation induced apoptosis in cultured sympathetic neurons. Similar results were obtained using primary cortical neurons in etoposide-induced intrinsic apoptosis model. Challenging neurons with cytotoxic drug, thapsigargin, did not reveal N-Bak protein expression, suggesting that its mRNA is translationally silent also in stressed primary neurons. The absence of N-Bak protein was further confirmed using quantitative mass spectrometry analysis, which did not reveal any peptide form samples representing healthy, stressed or apoptotic neurons. We also show that accelerated proteosomal degradation is not responsible for the absence of N-Bak protein in neurons. The open reading frame of N-Bak mRNA is prematurely terminated, being potential target for the nonsense mediated mRNA decay (NMD) pathway. We found that N-Bak mRNA is not a constitutively targeted by NMD, but instead, is relatively stable in neurons. Luciferase reporter assays showed that N-Bak mRNA is translationally repressed via cis-acting contextual elements in its untranslated regions. Finally, we demonstrate that N-Bak mRNA localizes into the uncharacterized granular structures in sympathetic neurons, and this distribution remains unchanged in apoptotic neurons. Our findings collectively demonstrate that multiple post-transcriptional mechanisms control N-Bak expression in neurons. These mechanisms may be part of the program that governs tight control over apoptosis in neurons. Our results also highlight the importance to further characterize diverse, still neglected post-transcriptional regulation mechanisms that can modulate apoptotic pathways in a various post-mitotic cells.Viimeisten kolmen vuosikymmenen tutkimustyön perusteella on saatu hyvä käsitys keskeisistä apoptoosia (ohjelmoitua solukuolemaa) välittävistä mekanismeista aitotumallisissa soluissa. Tietämyksemme näiden mekanismien säätelystä on kuitenkin edelleen vaillinainen. Viimeaikaiset tulokset geneettisistä ja molekyylitason tutkimuksista osoittavat, että solukuoleman käynnistyminen on rajoitetumpaa solutyypeissä, jotka eivät jakaudu (postmitoottiset solut), kuin useimmissa jakautuvissa soluissa. Tutkimukseni päämäärä on ollut apoptoosia hermosoluissa säätelevien tekijöiden erityispiirteiden parempi ymmärtäminen. Nisäkässoluissa apoptoosia säätelee Bcl-2-proteiiniperhe, jonka jäsenistä BH3-only-ryhmä ja apoptoosia edistävät proteiinit Bak ja Bax ovat erityisen tärkeitä apoptoosin aloitusvaiheessa. Useimmissa hermosolutyypeissä Bak-geenin ilmentymiseen vaikuttaa vaihtoehtoinen silmukointi. Neuronaalisen Bak:n silmukointimuodon, N-Bak:n, on esitetty koodittavan BH3-only ryhmän proteiinia, mutta tämän proteiinin olemassaolosta on ristiriitaisia käsityksiä. N-Bak-mRNA:ta on kuitenkin runsaasti hermosoluissa, mikä viittaa siihen, että geeniluennan jälkeiset säätelymekanismit säätelevät N-Bak-proteiinin ilmentymistä niissä. Tässä väitöskirjatyössä tutkimme molekyylitason mekanismeja, jotka säätelevät N-Bak:n ilmentymistä. Immunoblot-menetelmällä osoitimme, että N-Bak-proteiinia ei esiinny, ainakaan jatkuvasti, terveissä hermosoluissa. N-Bak-proteiinia ei havaittu sympaattisissa hermosoluissa, joille aiheutettiin apoptoosia poistamalta niiltä NGF-hermokasvutekijä, ja samankaltaisen tuloksen saimme aivokuoren hermosoluviljelmistä (cortical neurons), kun niille aiheutettiin apoptoosia etoposidilla. Myöskään hermosolujen käsittely myrkyllisellä thapsigargiinilla ei saanut N-Bak proteiinia näkyviin, mikä viittaa siihen, että sitä koodittavaa mRNA:ta ei käännetä proteiiniksi hermossoluviljelmissä edes stressitilanteessa. N-Bak-proteiinin puuttuminen osoitettiin lisäksi kvantitatiivisella massaspektrometriamenetelmällä, jossa ei löytynyt siitä peräisin olevia peptidejä terveissä, stressatuissa tai apoptoottisissa neuroneissa. Osoitimme vielä, että mahdollinen nopea hajotus proteasomeissa ei ole syynä N-Bak-proteiinin puuttumiseen. N-Bak-mRNA sisältää ennenaikaisen lopetuskodonin, mistä syystä se mahdollisesti hajotetaan NMD-reitin (nonsense mediated mRNA decay) kautta. Saimme selville, että N-Bak-mRNA ei joudu NMD-hajotusreitille vaan päinvastoin se on melko pysyvä hermosoluissa. Lusiferaasireportterimittaukset osoittivat, että tietyt N-Bak-mRNA:n ei-koodaavilla alueilla sijaitsevat alueet (cis acting elements) vaimentavat sen translaatiota. Lopuksi osoitimme, että N-Bak-mRNA paikantuu tuntemattomiin jyväsrakenteisiin sympaattisissa hermosoluissa, ja että tämä paikantuminen ei muutu apoptoottisissa soluissa. Loppupäätelmänä voidaan todeta, että tuloksemme osoittavat useiden geeniluennan jälkeisten mekanismien säätelevän N-Bak:n ilmentymistä hermosoluissa. Nämä mekanismit lienevät osa koneistoa, joka neuroneissa säätelee tiukasti apoptoosia. Tulostemme perusteella on myös syytä korostaaa, että on tärkeää tutkia enemmän huonosti tunnettuja geeniluennan jälkeisiä säätelymekanismeja, jotka vaikuttavat apoptoosireittien toimintaan useissa erilaistuneissa, jakautumattomissa solutyypeissä.
Subject: biosciences
Rights: This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
Molecula.pdf 2.248Mb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record