Kylmäsäilytyksen, laktoperoksidaasisysteemin aktivoinnin ja typpikaasukäsittelyn vaikutus raakamaidon bakteerien antibioottiresistenssiin

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-201611092982
Title: Kylmäsäilytyksen, laktoperoksidaasisysteemin aktivoinnin ja typpikaasukäsittelyn vaikutus raakamaidon bakteerien antibioottiresistenssiin
Author: Jääskeläinen, Susanna
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Agriculture and Forestry, Department of Food and Environmental Sciences
Publisher: Helsingfors universitet
Date: 2016
Language: fin
URI: http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-201611092982
http://hdl.handle.net/10138/169780
Thesis level: master's thesis
Discipline: Livsmedelsteknologi
Food Technology
Elintarviketeknologia
Abstract: Raakamaidon säilyvyyden parantamiseksi hyödynnettävä kylmäsäilytys suosii psykrotrofisten bakteerien kasvua. Psykrotrofeja pidetään ongelmallisina niiden tuottamien lämpökestävien pilaajaentsyymien vuoksi, mutta tämän lisäksi osa ihmiselle patogeenisista bakteereista kykenee kasvamaan maidon kylmäsäilytyslämpötiloissa. Raakamaidon psykrotrofien on myös aiemmissa tutkimuksissa havaittu olevan resistenttejä useille antibiooteille. Tutkielman kirjallisuuskatsauksessa perehdyttiin raakamaidon mikrobistoon sekä siihen, kuinka kylmäsäilytys sekä maidon säilytysaikaa pidentävät typpikaasukäsittely (N2) ja laktoperoksidaasisysteemin (LPS) aktivointi vaikuttavat raakamaidon bakteereihin. Kirjallisuuskatsauksessa perehdyttiin myös bakteerien antibioottiresistenssin syntyyn, leviämiseen ja mekanismeihin sekä antibioottiresistenssiin maitotiloilla ja raakamaidon bakteereilla. Lisäksi kirjallisuuskatsauksessa käsiteltiin raakamaidon bakteerien ja niiden antibioottiresistenssin tutkimiseen käytettyjä menetelmiä. Kokeellisen osuuden tavoitteena oli tutkia kylmäsäilytyksen sekä LPS- ja typpikaasukäsittelyjen vaikutusta raakamaidon bakteerien antibioottiresistenssiin. Käsittelemätöntä, N2-käsiteltyä ja LPS-käsiteltyä raakamaitoa säilytettiin 6 °C:n lämpötilassa ja gentamisiinille, keftatsidiimille, levofloksasiinille ja trimetopriimi-sulfametoksatsolille resistenttien mesofiilien ja psykrotrofien tasot määritettiin kokeen alussa sekä kolmen ja seitsemän vuorokauden kylmäsäilytyksen jälkeen. Raakamaidosta eristettyjen bakteeri-isolaattien antibioottiresistenssi- ja pilaajaominaisuuksia vertailtiin. Lisäksi isolaattien monimuotoisuutta tutkittiin rep-PCR-menetelmällä ja muutama isolaatti tunnistettiin sukutasolla 16S rRNA -geenin osittaiseen sekvenssiin perustuen. Tunnistetuista isolaateista tutkittiin PCR-pohjaisella menetelmällä tiettyjen antibioottiresistenssigeenien läsnäoloa. Kylmäsäilytysaika vaikutti raakamaidon antibioottiresistenttien bakteerien osuuksiin. Kontrollinäytteiden antibioottiresistenttien bakteerien osuus oli yleisesti, TS-resistenttejä bakteereja joissain tapauksissa lukuun ottamatta, pienimmillään seitsemän vuorokauden kylmäsäilytyksen jälkeen, jolloin maito ei kuitenkaan enää ollut mikrobiologisesti hyväksyttävää. Eri tavoin käsiteltyjen maitonäytteiden välillä oli runsaasti vaihtelua bakteerien antibioottiresistenssin esiintyvyydessä. LPS-näytteissä oli keskimäärin selvästi suurempia osuuksia antibioottiresistenttejä bakteereja kuin kontrollinäytteissä, kun taas N2-käsittelyn vaikutus antibioottiresistenttien bakteerien määriin vaihteli eri koeasetelmissa. Kaikille tutkituille antibiooteille resistenttien bakteeri-isolaattien proteaasin ja fosfolipaasin tuotto oli harvinaisempaa kuin harvemmille antibiooteille resistenttien isolaattien. LPS-näytteiden isolaateilla resistenssi kaikille tutkituille antibiooteille oli yleisempää ja proteaasin ja fosfolipaasin tuotto harvinaisempaa kuin kontrolli- ja N2-käsittelynäytteiden isolaateilla. Rep-PCR-sormenjälkien perusteella bakteeri-isolaateissa oli sekä useita samaa kantaa olevia bakteereja että useita erilaisia bakteerikantoja. Isolaateista kaksi tunnistettiin 16S rRNA -geenin osittaisen sekvenssin perusteella Pseudomonas-sukuisiksi ja kaksi Stenotrophomonas-sukuisiksi. Työssä ei saatu monistettua tutkittuja antibioottiresistenssigeenejä, mihin syynä voivat olla esimerkiksi bakteerien geenisekvenssien variaatiot, kyseisten geenien puuttuminen tai PCR-reaktion olosuhteet. MexA-geenin alukkeita Pseudomonas-isolaatille käyttäen saatiin monistettua geenituote, jonka sekvenssillä ei tietokannan perusteella kuitenkaan ollut homologiaa antibioottiresistenssigeenien kanssa. Lisätutkimuksia tarvittaisiin sen varmistamiseksi, onko tutkittu geeni yhteydessä antibioottiresistenssiin.The cold storage, utilized to increase the shelf life of raw milk, favors the growth of psychrotrophic bacteria. Psychrotrophs are considered as problematic because they produce heat-stable spoilage enzymes. In addition, some pathogenic bacteria are capable of growing at cold storage temperatures and it has been observed in previous studies that the psychrotrophs in raw milk can be resistant to several antibiotics. In the literature review section of this study, the microbial composition of raw milk and the effect of cold storage, nitrogen gas (N2) treatment and activation of the lactoperoxidase system (LPS) on the raw milk bacteria was reviewed; moreover, the evolution, spread and mechanisms of bacterial antibiotic resistance and the antibiotic resistance on dairy farms and of raw milk bacteria was reviewed. Also the methods to study raw milk bacteria and their antibiotic resistance were documented. The aim of the experimental part was to study the effects of cold storage, N2 gas treatment and LPS treatment on the levels of antibiotic resistant bacteria in raw milk. Untreated, N2-treated and LPS-treated raw milk samples were stored at 6 °C and the counts of bacteria resistant to gentamicin, ceftatzidime, levofloxacin and trimethoprim-sulfamethoxazole were determined in the beginning of the experiments and after three and seven days of cold storage. The antibiotic resistance and spoilage features of bacterial isolates selected from different plates were compared. In addition, DNA fingerprints of selected isolates were obtained by rep-PCR method and for a couple of isolates 16S rRNA gene partial sequencing was performed. The presence of certain antibiotic resistance genes for the isolates partially identified was investigated using a PCR-based method. The length of cold storage affected the proportions of antibiotic resistant bacteria in raw milk. The proportions of antibiotic resistant bacteria in the control milk sample were generally, with the exception of TS-resistant bacteria in some cases, at their lowest after seven days of cold storage when the milk was, though, microbiologically unacceptable. There was a lot of variation in the prevalence of bacterial antibiotic resistance between the milk samples treated differently. The proportions of resistant bacteria were on average clearly higher in LPS samples than in control samples, whereas the effect of the N2 treatment on the proportions of resistant bacteria varied between the experiments. The bacterial isolates resistant to all the considered antibiotics produced less frequently protease and phospholipase than the isolates resistant to fewer antibiotics. The isolates from LPS samples were more frequently resistant to all the antibiotics studied and produced less frequently protease and phospholipase than the isolates from control and N2-treated samples. On the basis of the rep-PCR fingerprints, there were both similar and different strains among the bacterial isolates. Based on the 16S rRNA partial gene sequence, two isolates were identified as Pseudomonas spp. and two isolates as Stenotrophomonas spp. The targeted antibiotic resistance genes were not detected among the considered isolates. Possible reasons can be variations in the gene sequences, suboptimal PCR conditions or that the isolates lacked the genes studied. A PCR product was obtained for one Pseudomonas isolate using mexA-F/R primers, but according to the database the gene sequence did not show homology with antibiotic resistance genes. Further analyses would be required to confirm if the gene studied is linked to antibiotic resistance.
Subject: raw milk
antibiotic resistance
psychrotrophs
lactoperoxidase
nitrogen gas treatment
cold storage
raakamaito
antibioottiresistenssi
psykrotrofit
laktoperoksidaasi
typpikaasukäsittely
kylmäsäilytys


Files in this item

Files Size Format View

There are no files associated with this item.

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record