Interaction of GluA1 AMPA receptor with Synapse-Associated Protein 97

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-51-2888-1
Title: Interaction of GluA1 AMPA receptor with Synapse-Associated Protein 97
Author: von Ossowski, Lotta
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Biological and Environmental Sciences, Department of Biosciences, Biokemian ja biotekniikan osasto
Publisher: Helsingin yliopisto
Date: 2017-02-03
Language: en
Belongs to series: URN:ISSN:2342-317X
URI: http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-51-2888-1
http://hdl.handle.net/10138/173251
Thesis level: Doctoral dissertation (article-based)
Abstract: Alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionate (AMPA) receptors are glutamate-gated cation channels and mediators of fast excitatory neurotransmission in the mammalian central nervous system. Trafficking and functional regulation of AMPA receptors GluA1-4 is carried out through numerous intracellular protein interactions and post-translational modifications. The aim of this thesis work was to study the selective interaction between AMPA receptor subunit GluA1 and synapse-associated protein 97 (SAP97), a protein scaffold belonging to the protein family of membrane associated guanylate kinase homologs. The interaction between SAP97 and GluA1 has been implicated in AMPA receptor trafficking, neuronal development and synaptic plasticity, while disturbances in normal levels of both GluA1 and SAP97 have been linked to neuropathologies such as Alzheimer s disease and schizophrenia. In the present study, a combination of biochemical and structural work was employed to gain detailed information on the selective interaction of GluA1 with SAP97 identifying molecular determinants involved in and regulating the interaction. X-ray crystallization screens of the second PDZ domain of SAP97 (SAP97PDZ2) yielded well-diffracting crystals both for the apo and ligand bound form. The solved crystal structure of the SAP97PDZ2-GluA1 peptide complex conformed to a conventional class I PDZ interaction with hydrogen bonds forming between the carboxylate group of the ultimate C-terminal residue of the peptide and main chain nitrogens in the carboxylate binding loop of the PDZ domain, and a hydrogen bond between the antepenultimate residue of the peptide and a conserved histidine in the αB helix lining the peptide binding groove. Beside these typical PDZ interactions, as a novel finding we observed contacts within the PDZ domain reorganizing upon peptide binding leading to a slight opening of the peptide binding groove facilitating better accommodation of the ligand. In vitro binding analysis of isolated PDZ domains and short GluA1 peptides showed that, in addition to the prototypic PDZ interaction, a C-terminal cysteine, C893 located upstream from the short PDZ binding motif on GluA1 participated in the interaction through a disulfide bond formed with cysteine C378 of SAP97 under in vitro conditions. Streptavidin pull-down experiments with full-length molecules expressed in cultured cells showed that the C893S mutation leads to a substantial reduction in binding of GluA1 to SAP97, confirming the involvement of C893 in the regulation of the interaction in live cells. Reactive cysteines, like C893, can in addition to disulfide bonds participate in other thiol modifications. In our work we constructed several deletion and cysteine replacement mutants of GluA1 and tested their sensitivity to S-nitrosylating agents nitrosoglutathione and nitrosocysteine. Out of the three C-terminal cysteine residues in GluA1, we identified C893 as the sole cysteine residue sensitive to a post-translational modification by nitric oxide (NO). Furthermore, we found evidence of a physical link between GluA1 and the NO generating neuronal enzyme nitric oxide synthase nNOS via SAP97. The results of the present study provide, for the first time, detailed structural information on the interaction between GluA1 AMPA receptor and SAP97. In addition to a canonical PDZ interaction, the association with SAP97 involves a reactive cysteine residue, C893, in GluA1 C-terminal tail, a potential regulatory target for nitric oxide and oxidative conditions.AMPA receptorer, bestående av underenheterna GluA1-4, är katjonkanaler vars genomsläpplighet styrs av till dem bundet glutamat och de ansvarar för snabb stimulerande signalöverföring i centrala nervsystemets synapser hos däggdjur. Reglering av AMPA receptorers funktion samt deras intracellulära trafik dirigeras av växelverkande proteiner och posttranslationella proteinmodifieringar. Syftet för denna doktorsavhandling var att studera den selektiva interaktionen mellan AMPA receptor GluA1 och SAP97, ett protein tillhörande proteinfamiljen av membran-associerade guanylatkinas homologer. Växelverkan mellan SAP97 och GluA1 påverkar AMPA receptorers intracellulära trafik, den neuronala utvecklingen och synaptisk plasticitet, medan störningar i normala nivåer av GluA1 och SAP97 har länkats till olika sjukdomstillstånd så som Alzheimers sjukdom och schizofreni. I denna studie tillämpades biokemiska metoder i kombination med röntgenkristallografi och NMR för att få detaljerad information om den selektiva interaktionen mellan GluA1 och SAP97 samt identifiera specifikt de molekyler som reglerar växelverkan mellan proteinerna. Med hjälp av röntgenkristallografi löstes kristallstrukturen för den andra PDZ-domänen av SAP97 (SAP97PDZ2) både i sin fria och ligandbundna form. Kristallstrukturen av SAP97PDZ2 tillsammans med GluA1 påvisade en konventionell klass I PDZ-interaktion där GluA1-peptidens yttersta C-terminala aminosyras karboxylatgrupp genom vätebindningar binds till den karboxylatbindande slingan i PDZ-domänen och GluA1-peptidens tredje sista aminosyra binds med ytterligare en vätebindning till en konserverad histidin-aminosyra i αB-helixen som kantar öppningen till den peptidbindande fåran. Förutom de typiska PDZ-interaktionerna upptäcktes det att intramolekylära kontakter inom PDZ-domänen omorganiseras då peptiden binds vilket leder till att den peptid-bindande fåran öppnas en aning för att ge bättre utrymme för peptiden. In vitro- analys av isolerade PDZ-domäner och GluA1-peptider avslöjade förutom den prototypiska PDZ-interaktionen en disulfidbindning som uppstår mellan ett C-terminalt cystein C893 uppströms från det korta PDZ-bindande motivet i GluA1 och cystein C378 i SAP97 under in vitro förhållanden. Från att ha studerat enskilda SAP97 PDZ-domäner och korta GluA1-peptider övergick vi till att uttrycka hela rekombinanta proteiner i odlade celler. Mutationen C893S i GluA1 ledde till en betydlig reducering av bindningsstyrkan till SAP97 vilket bekräftar att C893 deltar i regleringen av interaktionen i levande celler. Reaktiva cysteiner, likt C893, kan förutom disulfidbindningar också delta i andra tiolmodifieringar. I studien konstruerades flera muterade versioner av GluA1, både N- och C-terminala deletioner samt mutantproteiner vars enskilda cysteiner ersatts med aminosyran serin. Genom att undersöka mutantproteinernas känslighet för nitrosoglutation och nitrosocystein kunde vi fastställa att C893, som det enda cysteinet utav tre i den C-terminala cytosoliska svansen av GluA1, är känslig för en posttranslationell modifiering genom kväveoxid (NO). Därutöver, fann vi bevis för en fysisk länk mellan GluA1 och det NO-genererande enzymet neuronalt kväveoxidsyntas (nNOS) via SAP97. Resultaten av denna studie förser oss med, för första gången, detaljerad strukturell information om interaktionen mellan AMPA receptor GluA1 och SAP97. Förutom den kanoniska PDZ-interaktionen innefattar bindningen med SAP97 ett reaktivt cystein, C893, i den C-terminala ändan av GluA1, ett potentiellt föremål för reglering genom kväveoxid och oxidativa förhållanden.
Subject: biokemia
Rights: This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
interact.pdf 3.510Mb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record