Identification of bacterial biothreat agents and pathogens by rapid molecular amplification methods

Abstract

Rapid detection and identification of the pathogenic agents in biological weapons is critical in limiting their impact when used against civilian or military targets. Fast and accurate detection is also important in clinical microbiology where modern protocols seek to extend the diagnostic technology of automated central laboratories to the patient bedside or doctor s office, i.e., so-called point-of-care (POC) testing. The aim of this study was to develop rapid and accurate detection and identification assays for biothreat agents and other pathogenic bacteria from diverse sample types using molecular amplification methods. Secondly, the aim was to evaluate field-deployable platforms for use in remote or resource-limited locations.

This thesis consists of a series of studies of pathogenic bacteria that can cause severe disease in humans. The pathogens studied, Yersinia pestis, Bacillus anthracis, Francisella tularensis, Vibrio cholerae, and Brucella spp., have been listed as biothreat and biological weapons agents. In addition to the above-mentioned biothreat agents, real-time PCR assays were developed for the detection of Bacillus thuringiensis and Yersinia pseudotuberculosis. We also conducted an international multicentre accuracy study of a novel isothermal amplification platform. The main methods used in these studies were real-time PCR and a novel isothermal amplification technique known as strand invasion based amplification (SIBA). Several sample types, such as DNA, powder, spiked, environmental, and clinical samples were utilised in these studies.

The developed multiplexed real-time PCR for the simultaneous identification of Y. pestis and Y. pseudotuberculosis was shown to be specific and sensitive, and was validated with spiked clinical samples. For the detection of non-pathogenic and pathogenic V. cholerae from environmental samples, real-time PCR assays for the toxR and ctxA target genes were developed, and specificity was tested with a panel of several serotypes of Vibrio cholerae and other bacteria and with spiked environmental water samples. The V. cholerae and real-time PCR assays for Y. pestis, B. anthracis, F. tularensis, and Brucella spp. Were transferred to a small, field-deployable RAZOR instrument. A field-training assay with a simple sample preparation technique was developed and tested in field conditions for powder samples with insecticidal simulant containing spores of B. thuringiensis. In the final study, the accuracy of a newly-developed portable instrument, based on isothermal amplification, was assessed in an international multicentre study using 1160 faecal patient samples for the specific detection of toxigenic Clostridium difficile. This new test system was found to be comparable to the methods in routine use at three participating hospital laboratories.

Molecular amplification, such as real-time PCR and isothermal amplification are sensitive and specific methods that are suitable for rapid testing of bacterial biothreat agents and pathogenic bacteria from several types of samples following suitable sample preparation. With appropriate instruments, molecular nucleic acid amplification methods can be of significant advantage in field use for rapid identification of biothreat agents. These methods are also useful in POC situations where fast and reliable identification of pathogens is important.

Tauteja aiheuttavien mikrobien nopea tunnistaminen on tärkeää, mikäli niitä käytetään biouhkatarkoituksissa siviiliväestöä tai sotilaskohteita vastaan, jotta oikeanlainen suojautuminen ja mahdollisten uhrien hoito voidaan aloittaa ripeästi. Potilaan tehokkaan hoidon kannalta nopean, tarkan ja laadukkaan analyysin tekeminen potilaasta otetusta näytteestä on tarpeellista. Tässä tutkimuksessa kehitettiin herkkiä molekyylibiologiaan perustuvia tunnistustestejä bakteereille, jotka voivat aiheuttavaa vakavia tauteja ja joita on mahdollista käyttää bioterrorismiteon välineinä. Lisäksi evaluoitiin laitteita, jotka soveltuvat mikrobien nopeaan tunnistamiseen kenttäolosuhteissa taikka potilasnäytteiden vieritestauksessa.

Tutkimuksessa kehitettiin reaaliaikaiseen geenimonistukseen perustuvat tunnistustestit useille vakavia tauteja aiheuttaville bakteereille, jotka ovat myös mahdollisia biouhkamikrobeja. Kehitetyistä testeistä yksi tunnistaa samanaikaisesti sekä ruttoa aiheuttavan biouhkabakteerin Yersinia pestiksen että ruokaperäistä ripulitautia aiheuttavan Yersinia pseudotuberculosiksen. Toisen tutkimuksessa kehitetyn testin avulla voidaan tunnistaa Brucella-suvun bakteerit, jotka voivat aiheuttaa kuumetautia ihmisillä ja sikiökuolemia eläimillä (ns.luomistauti). Kolmannen kehitetyn testin avulla voidaan tunnistaa koleran aiheuttajabakteeri Vibrio cholerae. Kehitetyt menetelmät todettiin tarkoiksi ja luotettaviksi käyttämällä laajaa testipaneelia sekä kliinisiä ja ympäristönäytteitä, joihin oli lisätty tutkittavaa bakteeria. Lisäksi työssä siirrettiin sekä uusia että aiemmin kehitettyjä menetelmiä Yersinia pestis, Bacillus anthracis (pernaruton aiheuttaja) ja Francisella tularensis (jänisruton aiheuttaja) bakteerien tunnistamiseksi kenttäkäyttöiselle RAZOR-laitteistolle, jonka herkkyys ja tarkkuus todettiin tutkimuksessa vertailukelpoiseksi suuremman kokoluokan laboratoriolaitteistojen kanssa ja soveltuvuus kenttäkäyttöön hyväksi. Mainittujen testien lisäksi tutkimuksessa kehitettiin myös menetelmä, jonka avulla voidaan harjoitella jauhenäytteiden keräämistä, käsittelyä ja analysoimista turvallisesti pernaruttobakteeria jäljittelevän vaarattoman Bacillus thuringiensis bakteerin itiöitä sisältävän jauheen avulla.

Tutkimuksen viimeisessä vaiheessa tehtiin laaja kliininen evaluaatio uuden pienikokoisen laitteiston tarkkuuden ja käytettävyyden arvioimiseksi vakavaa ripulitautia aiheuttavan Clostridium difficile -bakteerin tunnistamisessa. Evaluaatioon osallistui kahden suomalaisen kliinisen mikrobiologian laboratorion lisäksi ranskalainen sairaalamikrobiologian laboratorio, ja yhteensä tutkimuksessa analysoitiin 1160 potilasnäytettä. Tämä uusi suomalaisen valmistajan isotermaaliseen geenimonistukseen perustuva laite todettiin tutkimuksessa yhtä tarkaksi kuin rutiinikäytössä olevat menetelmät.

Tutkimuksessa kehitettyjä menetelmiä biouhkamikrobien tunnistamiseksi voidaan käyttää puolustusvoimien kenttälaboratoriossa, joka kykenee tehtäviin niin kotimaassa maapuolustuksen tukena, muille viranomaisille annettavan virka-avun yhteydessä taikka kansainvälisissä operaatioissa. Kenttälaboratorio on varustettu vaarallisten mikrobien nopeaan tunnistamiseen soveltuvin menetelmin ja laittein, joita tässä tutkimuksessa evaluoitiin ja todettiin luotettaviksi ja kenttäkäyttöön soveltuviksi. Samankaltaiset laitteet sopivat hyvin myös potilaiden vieritestaukseen ja pikadiagnostiikkaan. Kuten kenttäkäytössä, myös vieritestaukseen tarvitaan laitteita, jotka ovat tarkkoja, helppokäyttöisiä ja kestäviä. Kliinisessä mikrobiologiassa viimeaikainen trendi onkin ollut diagnostisen teknologian tuominen potilaan lähelle vieritestauksen avulla. Molekyylibiologia soveltuu hyvin sekä vieritestaukseen, että biouhkamikrobien tunnistamiseen kenttäolosuhteissa.