Leuconostoc bacteriocins and their application in genome editing

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-51-3204-8
Title: Leuconostoc bacteriocins and their application in genome editing
Author: Wan, Xing
Other contributor: Helsingin yliopisto, maatalous-metsätieteellinen tiedekunta, elintarvike- ja ympäristötieteiden laitos
Helsingfors universitet, agrikultur-forstvetenskapliga fakulteten, institutionen för livsmedels- och miljövetenskaper
University of Helsinki, Faculty of Agriculture and Forestry, Department of Food and Environmental Sciences, Division of Microbiology and Biotechnology
Publisher: Helsingin yliopisto
Date: 2017-06-09
Language: en
Belongs to series: URN:ISSN:2342-5431
URI: http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-51-3204-8
http://hdl.handle.net/10138/183444
Thesis level: Doctoral dissertation (article-based)
Abstract: Leuconostocs are lactic acid bacteria used as starters in food fermentations. They can also be spoilage bacteria, especially in vacuum packed meat products. Many Leuconostocs produce antimicrobial peptides, also known as bacteriocins. Leuconostoc bacteriocins are usually small, less than 10 kDa non-modified peptides, which are secreted by dedicated transporters. These bacteriocins kill many different bacteria, including strains of Enterococcus, Listeria, and Staphylococcus genera. Sensitivity to bacteriocins is usually dependent on a specific receptor on the target cell membrane. On Listeria cell membrane, mannose-phosphotransferase system Man-PTS has been shown to be the target for bacteriocins leucocins A and C from Leuconostoc. These class IIa bacteriocins bind to the subunit IIC (MptC) of Man-PTS and open the transporter, which leads to cell leakage and eventually cell death. Bacteriocin producers express specific immunity proteins, which protect the producer cells by blocking the transporter pore. In this doctoral dissertation, the bacteriocins produced by Leuconostoc carnosum 4010 were studied. The strain 4010 is a commercial protective culture for vacuum packaged meat products. The strain produces two antilisterial bacteriocins, leucocins A and C. In this study, the strain was found to produce a third bacteriocin, leucocin B, which is active against some Leuconostoc and Weissella strains. Genes required for the production of the three leucocins were characterised. The leucocin genes were arranged in operons on two native plasmids. A single ABC-transporter was found in the strain 4010 and was believed to carry out the bacteriocin secretion for all three leucocins. Immediately downstream of the leucocin genes lcnA, lebB, and lecC, putative immunity genes lcnB, lebI, and lecI were found. The immunity mechanisms of leucocin C was studied by expressing the lecI gene in L. monocytogenes. LecI producing Listeria was less sensitive to the leucocin C, showing the immunity function of LecI. By cloning the leucocin genes in plasmid vectors, active bacteriocins were produced in heterologous hosts Escherichia coli and Lactococcus lactis. Finally, leucocins A and C were used in a Lc. lactis genome editing method developed in this study. It has been shown that expression of Listerial mptC gene in Lc. lactis renders the host sensitive to class IIa bacteriocins. In this doctoral study, a counterselection method based on bacteriocin sensitivity was developed to select the loss of a plasmid. Listerial mptC gene was cloned in an integration vector aiming at a chromosomal deletion, and the plasmid was transferred into Lc. lactis. When the bacteriocin sensitive integrants were cultured with leucocin A or C, only the cells which had lost the mptC-plasmid through a second homologous recombination could survive. The second recombination may also cause the desired deletion. With this bacteriocin counterselection method, fragments up to 35 kb were deleted from Lc. lactis chromosome. The results obtained from this doctoral study provide further knowledge of Leuconostoc bacteriocins and their scientific use.Leuconostoc-suvun bakteerit ovat elintarvikkeiden hapatteina käytettyjä maitohappobakteereita. Leukonostokit voivat olla myös pilaajabakteereita, erityisesti lihatuotteissa. Monet Leukonostokit tuottavat antimikrobisia peptidejä eli bakteriosiineja. Leukonostokkien tuottamat bakteriosiinit ovat lähes aina pieniä, alle 10 kDa kokoisia modifioimattomia peptidejä, jotka eritetään spesifisillä kuljettimilla ulos solusta. Ne tappavat monia erilaisia bakteereita, kuten Enterococcus, Listeria, ja Staphylococcus –sukujen kantoja. Bakteerien herkkyys bakteriosiineille perustuu yleensä spesifiseen reseptoriin solun pinnalla. Listerian solukalvolla olevan mannoosi-fosfotransferaasi Man-PTS -kuljettimen on osoitettu toimivan reseptorina mm leukonostokkien tuottamille leukosiini A:lle ja C:lle. Nämä luokan IIa bakteriosiinit tarttuvat Man-PTS –kuljettimen alayksikkö IIC:hen (MptC), ja aiheuttavat kuljettimen avautumisen. Avoin kuljetin toimii vuotavana reikänä solukalvolla, jolloin solu kuolee. Bakteriosiinien tuottajilla on itsellään erityinen immuniteettiproteiini, joka suojaa tuottajasolua tukkimalla avoimen kuljettimen. Tässä väitöstyössä tutkittiin Leuconostoc carnosum 4010 –bakteerikannan tuottamia bakteriosiineja. Ln. carnosum 4010 on vakuumipakattujen lihatuotteiden kaupallinen suojaviljelmäkanta, joka estää L. monocytogenes –bakteerin kasvua tuottamalla kahta Listeria-aktiivista bakteriosiinia, leukosiineja A ja C. Työssä osoitettiin 4010-kannan tuottavan myös kolmatta bakteriosiinia, leukosiini B:tä, joka tappaa mm Leuconostoc- ja Weissella -bakteerikantoja. Työssä karakterisoitiin näiden kolmen bakteriosiinin tuottoon tarvittavat geenit 4010-kannassa. Leukosiinigeenien osoitettiin olevan järjestäytyneinä operoneiksi kahdessa eri plasmidissa. Bakteriosiinien erittämiseen löytyi vain yksi kuljetin, jonka uskotaan erittävän kaikkia kolmea leukosiinia. Kaikkien leukosiinigeenien, lcnA, lebB, ja lecC, perässä oli todennäköiset immuniteettigeenit lcnB, lebI, ja lecI. Leukosiini C:n immuniteettimekanismia tutkittiin ilmentämällä lecI-geeniä L. monocytogenes –kannassa. LecI:tä tuottava Listeria sieti paremmin bakteriosiinia, mikä osoitti LecI:n olevan leukosiini C:n immuniteettiproteiini. Aktiivisia leukosiineja tuotettiin heterologisissa Escherichia coli ja Lactococcus lactis –isäntäkannoissa kloonaamalla bakteriosiinigeenit plasmidivektoreihin. Lopuksi leukosiineja A ja C käytettiin tässä työssä kehitetyssä Lc. lactis –bakteerin genominmuokkausmenetelmässä. Aiemmin on osoitettu, että Listerian mptC-geenin ilmentäminen Lc. lactis –bakteerissa tekee laktokokkisolusta bakteriosiineille herkän. Tätä ominaisuutta hyödynnettiin vastaselektiossa, jossa estetään plasmidin sisältävien solujen kasvu. Listerian mptC-geeni liitettiin kromosomaalista deleetiota varten rakennettuun integraatiovektoriin, joka siirrettiin Lc. lactis –soluihin. Vektorin integraatio kromosomiin tekee kannasta bakteriosiiniherkän. Kasvatettaessa integranttia leukosiini A:n tai C:n kanssa, vain ne solut, joista mptC-integraatiovektori on toisen homologisen rekombinaation kautta poistunut, pystyvät kasvamaan. Vektorin poistuessa tapahtuu mahdollisesti myös haluttu kromosomaalinen deleetio. Tämän bakteriosiini-vastaselektiomenetelmän avulla poistettiin 17-35 kb kokoisia paloja Lc. lactis –kannan kromosomista. Tämän työn tulokset lisäävät tietoamme maitohappobakteerien antimikrobisista ominaisuuksista ja bakteriosiinien käyttömahdollisuuksista tieteellisissä sovelluksissa.
Subject:
Rights: Julkaisu on tekijänoikeussäännösten alainen. Teosta voi lukea ja tulostaa henkilökohtaista käyttöä varten. Käyttö kaupallisiin tarkoituksiin on kielletty.


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
leuconoc.pdf 1023.Kb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record