Trimeric autotransporters and their ligands : structural studies

Abstract

During host invasion, pathogenic bacteria express a variety of virulence factors that facilitate their escape from the immune system and thus enable propagation of the infection. The trimeric autotransporter adhesins (TAAs) are one example of a specialised virulence factors expressed by many Gram- negative bacteria, such as Yersinia spp, Escherichia coli, Moraxella catarrhalis, and others. TAAs are highly modular proteins consisting of passenger and translocation domain. Passenger domains are variable domains, constructed of repetitive, structurally homologous subdomains: heads, connectors and stalks. In contrast, the translocation domain is a highly conserved β-barrel anchoring the passenger into the outer membrane of bacteria. TAAs are a key part of Gram-negative bacterial virulence, and as such could be potential drug targets. However, to develop novel drugs, we need to understand the nature of TAAs as well as the molecular details of their interactions with host molecules. In my thesis, I showed that the intact TAA translocation domain is essential and capable of translocating heterologous passengers to the bacterial cell surface. Additionally, heterotrimeric passenger domains have the functionality of the individual monomers, which can generate an extra diversity on the bacterial cell surface to combat immune attack, especially as multiple TAA genes are present in one bacterium. In addition, I have solved the structure of a fragment of the ubiquitous surface protein A (UspA1) from M. catarrhalis, revealing the C3d-binding surface. C3d binding by UspAs is essential in serum resistance preventing formation of the membrane attack complex. Finally, I studied interactions between E. coli immunoglobulin binding protein D (EibD) and IgG Fc. Eibs bind to the Fc region of IgG and IgA in a non-immune manner, which appears to mask the bacterium from the immune system. Attempts to solve crystallographic structure of the EibD-Fc complex were not successful, but they resulted in the another binding. I showed that a single mutation within the linker region between CH2 and CH3 domains of IgG Fc could drastically change the relative structural arrangement of constant heavy chains 2 and 3.

Tunkeutuessaan isäntäeliöön patogeeniset bakteerit tuottavat useita virulenssitekijöitä, jotka suojaavat niitä isäntäeliön immuunipuollustukselta ja siten mahdollistavat infektion etenemisen. Trimeeriset kuljettajaproteiini adhesiinit (lyhenne TAA:t, engl. Trimeric Autotransporter Adhesins, TAAs) ovat esimerkki tällaisista erikoistuneista virulenssitekijöistä, joita tuottavat monet Gram-negatiiviset bakteerit, kuten Yersinia suvun bakteerit, Escherichia coli ja Moraxella catarrhalis. TAA:t ovat modulaarisia proteiineja, jotka koostuvat kantaja- ja siirtoyksiköistä eli -domeeneista. Kantajadomeeneilla on vaihteleva yksikkörakenne, koostuen toistuvista, rakenteellisesti samankaltaisista alayksiköistä, tarkemmin pää-, liitin- ja varsiyksiköistä (engl. heads, connectors and stalks). Siirtoyksiköillä puolestaan on erittäin konservoitunut ß-tynnyrirakenne, joka ankkuroi kantajayksikön bakteerin ulkoiseen solukalvoon.

TAA proteiinit ovat olennainen osa Gram-negatiivisten bakteerien taudinaiheuttamiskykyä eli virulenssia, ja ovat siten mahdollisia lääkeaineiden sitoutumiskohteita. Kehittääksemme uusia lääkeaineita meidän tulee kuitenkin ymmärtää TAA proteiinien toimintaperiaate - erityisesti TAA proteiinien vuorovaikutus isäntäeliön kanssa molekyylitasolla.

Olen osoittanut väitöskirjassani, että TAA siirtodomeenit kykenevät kuljettamaan toisista eliöistä peräisin olevia kantajadomeeneja bakteerin solukalvolle, ja ovat lisäksi olennainen osa tätä prosessia. Lisäksi heterotrimeeristen kantajadomeenien alayksiköt kykenevät toimimaan itsenäisesti, mikä tehostaa bakteerin kykyä puollustautua isäntäeliön immuniteettiä vastaan. Tätä bakteerin TAA proteiineja hyödyntävän suojauksen monimuotoisuutta lisää myös se, että yhdellä bakteerilla on useita TAA proteiineja koodaavia geenejä.

Olen lisäksi ratkaissut M. catarrhalis bakteerin UspA1 proteiinin (engl. ubiquitous surface protein A) rakenteen osan, joka sisältää niin kutsutun C3d proteiinin sitoutumisalueen. C3d proteiinin sitoutuminen UspA1 proteiiniin on olennainen osa verenkierrossa tapahtuvaa immuunipuolustusta, jossa se estää solukalvoon tunkeutumista edellyttävän proteiinikompleksin muodostumisen.

Edellä mainittujen proteiinien lisäksi tutkin myös E. colin immunoglobuliinia sitovan proteiini D:n (EibD, engl. E. coli immunoglobulin binding protein D) ja IgG Fc proteiinin välistä vuorovaikutusta. Eib proteiinit sitoutuvat sekä IgG:n että IgA:n Fc-alueelle tavalla, joka vaikuttaa suojaavan bakteeria isäntäeliön immuunipuollustuksen hyökkäykseltä. Eib-Fc proteiinikompleksin rakenteen ratkaiseminen ei ole toistaiseksi onnistunut, mutta niiden välisestä vuorovaikutuksesta saatiin siitä huolimatta uutta tietoa. Väitöskirjatutkimuksessani osoitin, että yksittäinen mutaatio IgG Fc:n raskaiden ketjujen vakiodomeenien CH2 ja CH3 välisellä linkkerialueella voi selkeästi vaikuttaa näiden domeenien väliseen rakenteelliseen järjestäytymiseen.