Enzyme molecular choreography : studies on soluble inorganic pyrophosphatases

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:ISBN:978-952-10-5895-0
Title: Enzyme molecular choreography : studies on soluble inorganic pyrophosphatases
Author: Oksanen, Esko
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Science, Department of Chemistry, Laboratory of Organic Chemistry
Institute of Biotechnology, University of Helsinki
Publisher: Helsingin yliopisto
Date: 2009-12-11
Language: en
URI: http://urn.fi/URN:ISBN:978-952-10-5895-0
http://hdl.handle.net/10138/21029
Thesis level: Doctoral dissertation (monograph)
Abstract: Inorganic pyrophosphatases (PPases, EC 3.6.1.1) hydrolyse pyrophosphate in a reaction that provides the thermodynamic 'push' for many reactions in the cell, including DNA and protein synthesis. Soluble PPases can be classified into two families that differ completely in both sequence and structure. While Family I PPases are found in all kingdoms, family II PPases occur only in certain prokaryotes. The enzyme from baker's yeast (Saccharomyces cerevisiae) is very well characterised both kinetically and structurally, but the exact mechanism has remained elusive. The enzyme uses divalent cations as cofactors; in vivo the metal is magnesium. Two metals are permanently bound to the enzyme, while two come with the substrate. The reaction cycle involves the activation of the nucleophilic oxygen and allows different pathways for product release. In this thesis I have solved the crystal structures of wild type yeast PPase and seven active site variants in the presence of the native cofactor magnesium. These structures explain the effects of the mutations and have allowed me to describe each intermediate along the catalytic pathway with a structure. Although establishing the ʻchoreographyʼ of the heavy atoms is an important step in understanding the mechanism, hydrogen atoms are crucial for the mechanism. The most unambiguous method to determine the positions of these hydrogen atoms is neutron crystallography. In order to determine the neutron structure of yeast PPase I perdeuterated the enzyme and grew large crystals of it. Since the crystals were not stable at ambient temperature, a cooling device was developed to allow neutron data collection. In order to investigate the structural changes during the reaction in real time by time-resolved crystallography a photolysable substrate precursor is needed. I synthesised a candidate molecule and characterised its photolysis kinetics, but unfortunately it is hydrolysed by both yeast and Thermotoga maritima PPases. The mechanism of Family II PPases is subtly different from Family I. The native metal cofactor is manganese instead of magnesium, but the metal activation is more complex because the metal ions that arrive with the substrate are magnesium different from those permanently bound to the enzyme. I determined the crystal structures of wild type Bacillus subtilis PPase with the inhibitor imidodiphosphate and an inactive H98Q variant with the substrate pyrophosphate. These structures revealed a new trimetal site that activates the nucleophile. I also determined that the metal ion sites were partially occupied by manganese and iron using anomalous X- ray scattering.Entsyymit ovat biologisia katalyyttejä, jotka nopeuttavat soluissa tapahtuvia kemiallisia reaktioita. Vaikka entsyymejä on tutkittu vuosikymmeniä, ovat niiden toimintamekanismit edelleen puutteellisesti ymmärrettyjä. Epäorgaaniset pyrofosfataasit ovat entsyymejä, jotka katalysoivat pyrofosfaatin pilkkoutumista kahdeksi fosfaatti-ioniksi. Tämä reaktio tuottaa käyttövoiman monille solun prosesseille, kuten proteiinien tai DNA:n synteesille. Liukoiset pyrofosfataasit voidaan jakaa kahteen perheeseen, joiden aminohappojärjestys ja rakenne ovat täysin erilaiset. Ensimmäiseen perheeseen kuuluva hiivan pyrofosfataasi on erittäin perusteellisti tutkittu entsyymi, mutta sen tarkka toimintamekanismi on pysynyt arvoituksena. Entsyymi hyödyntää kahdenarvoisia metalli-ioneja, luonnossa magnesiumia, joista kaksi on pysyvästi sitoutunut entsyymiin ja kaksi saapuu substraatin mukana. Reaktioon kuuluu nukleofiilisen happiatomin aktivointi ja tuotteen poistumiseen on useita mahdolisia reittejä. Tässä työssä olen määrittänyt muokkaamattoman hiivan pyrofosfataasin ja seitsemän variantin kiderakenteet magnesiumin kanssa. Nämä rakenteet selittävät mutaatioden vaikutukset katalyysiin ja mahdollistivat reaktion jokaisen välituotteen rakenteellisen kuvauksen. Vaikka tämä 'atomikoreografia' onkin tärkeä askel mekanismin ymmärtämisessä, ovat vetyatomit keskeisessä osassa mekanismissa. Yksikäsitteisin menetelmä vetyatomien paikkojen määrittämiseen on neutronikristallografia. Hiivan pyrofosfataasin neutronirakenteen määrittämiseksi tuotin perdeuteroitua entsyymiä ja kasvatin siitä suuria kiteitä. Koska kiteet eivät olleet stabiileja huoneenlämmössä, kehitetttin neutronimittauksia varten jäähdytyslaite. Tutkittasessa rakenteellisia muutoksia reaaliajassa aikaerotteisen kristallografian avulla tarvitaan fotolysoitava substraatin esiaste. Syntetisoin tällaisen ehdokasmolekyylin ja selvitin sen fotolyysikinetiikan, mutta valitettavasti sekä hiivan että Thermotoga maritiman pyrofosfataasit hydrolysoivat tämän molekyylin. Perheen II pyrofosfataasien mekanismi on hieman erilainen kuin ensimmäisellä perheellä, erityisesti metalliaktivaation osalta. Määritin Bacillus subtiliksen pyrofosfataasin rakenteen inhibiittori imidodifosfaatin kanssa sekä inaktiivisen H98Q variantin rakenteen pyrofosfaatin kanssa. Näistä rakenteista paljastui uudenlainen kolmen metalli-ionin muodostelma nukleofiilin aktivoimiseen.
Subject: orgaaninen kemia
Rights: This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
enzymemo.pdf 4.162Mb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record