The Human UDP-Glucuronosyltransferases : Studies on Substrate Binding and Catalytic Mechanism

Näytä kaikki kuvailutiedot



Pysyväisosoite

http://urn.fi/URN:ISBN:978-952-10-5185-2
Julkaisun nimi: The Human UDP-Glucuronosyltransferases : Studies on Substrate Binding and Catalytic Mechanism
Tekijä: Patana, Anne-Sisko
Muu tekijä: Helsingin yliopisto, biotieteellinen tiedekunta, bio- ja ympäristötieteiden laitos
Julkaisija: Helsingin yliopisto
Päiväys: 2009-02-06
Kieli: en
URI: http://urn.fi/URN:ISBN:978-952-10-5185-2
http://hdl.handle.net/10138/21995
Opinnäytteen taso: Väitöskirja (artikkeli)
Tiivistelmä: Elimistömme altistuu jatkuvasti lukemattomille vierasaineille, mm. lääkkeille, ympäristökemikaaleille ja ruoan lisäaineille. Nämä vierasaineet ovat usein hyvin rasvaliukoisia eikä niitä voida poistaa elimistöstä ilman rakennemuokkausta. Vierasainemetaboliassa nämä elimistön ulkopuolelta tulevat yhdisteet muokataan entsymaattisesti vesiliukoisempaan ja vähemmän haitalliseen muotoon ja siten niiden erittymisen elimistöstä mahdollistuu. UDP-glukuronosyltransferaasi-entsyymit (UGTt) katalysoivat glukuronihappo-tähteen siirtoa UDP-glukuronihapolta (UDPGA) vierasainemolekyylille (aglykoni), muodostaen aglykonista riippuen yleensä joko O- tai N-glukuronideja. Lääkeaineiden ja ympäristökemikaalien lisäksi UGT-entsyymit katalysoivat joidenkin elimistön omien molekyylien metaboliaa. Nykyään tunnetaan 19 ihmisen UGT-entsyymiä, jotka aminohapposekvenssin ja geenijärjestyksen perusteella jaetaan kolmeen alaperheeseen: UGT1A, UGT2A, ja UGT2B. Useimmat UGTt kykenevät katalysoimaan monen eri aglykonin glukuronidaatiota; toisaalta sama aglykoni voi toimia substraattina monelle eri UGT:lle. UGTt sijaitsevat endoplasmisessa kalvostossa ja niiden toiminnallinen yksikkö koostuu oletettavasti kahdesta monomeeristä. UGT1A1-entsyymi katalysoi bilirubiinin, hemoglobiinin hajoamistuotteen, glukuronidaatiota. Alentuneet entsyymiaktiivisuudet voivat johtaa patologiseen tilaan, jossa elimistön bilirubiinitasot ovat kohonneet, kuten tapahtuu esimerkiksi UGT1A1:n Y486D mutaation seurauksena. Jaetuista eksoneista johtuen tämän mutaation suhteen homotsygooteilla yksilöillä Y486D mutaatio esiintyy UGT1A1:n lisäksi kaikissa muissakin UGT1A alaperheen entsyymeissä. Tutkimuksessamme todettiin, että jos kaksi keskenään erilaista UGT-monomeeriä muodostaa toiminnallisen entsyymin, mutaation haittavaikutukset elimistössä voivat lieventyä. UGT-entsyymien tuottaminen sekä puhdistaminen aktiivisena on hankalaa, eikä niiden kolmiuloitteista rakennetta toistaiseksi tunneta. Tämän johdosta olen tutkinut UDPGA:n sitoutumiskohtaa sekä katalyyttistä mekanismia eri UGT-entsyymeissä mutageneesin, aktiivisuus- ja kinetiikkamittausten sekä homologiamallituksen avulla. Olemme havainneet, että aminohappotähteet H371, E379, D395 and Q396 (numerointi UGT1A6:n mukaan) osallistuvat UDPGA:n sitomiseen. Lisäksi olemme osoittaneet, että ihmisen UGT-entsyymeissä aspartaatti ja histidiini muodostavat katalyyttisen parin. Katalyyttisen histidiinin (H37 UGT1A9-entsyymissä) tehtävä on erilainen O- ja N-glukuronidaatiossa. Tutkimus lisää tietoa UGT-entsyymeistä ja siitä voi olla hyötyä esimerkiksi lääkeaineiden metaboliatutkimuksissa.UDP-glucuronosyltransferases (UGTs) are membrane bound glycosyltransferases located in the endoplasmic reticulum (ER). They catalyse the transfer of glucuronic acid from UDP-glucuronic acid (UDPGA) to endogenous or exogenous compounds. As a consequence the aqueous solubility of the substrate (aglycone) is increased and it is more easily excreted from the body. UGTs consist of two domains located on the lumenal side of the ER membrane, a single-pass transmembrane helix and a short cytosolic tail. 19 different UGTs are known in man and, based on sequence and gene organisation, they are divided into three subfamilies: UGT1A, UGT2A, and UGT2B. The functional unit of UGTs probably consists of two or more monomers. Bilirubin, a degradation product of haemoglobin, is glucuronidated by UGT1A1. The UGT1A1 Y486D mutation causes hyperbilirubinemia and, due to exon sharing in the UGT1A subfamily, individuals that are homozygous for the 1A1-Y486D mutation carry the corresponding mutation in all their nine different UGT1As. Recombinant UGT1A6 carrying this mutation, 6YD, had drastically decreased glucuronidation activity and increased Km for both the aglycone and UDPGA. Co-infection of the 6YD mutant with UGT1A4 partially restored the glucuronidation activity and decreased the Kms of substrates to close to wild-type levels. Strong evidence for the formation of a tight hetero-oligomer was provided by the co-purification experiment of 6YD and UGT1A4. In the absence of a three-dimensional structure of the full-length UGT, I used other approaches to obtain structural information. Binding of the UDPGA was studied in UGT1A6, UGT1A9, UGT1A10 and UGT2B7 by site-directed mutagenesis, modelling, single-point activity and kinetic measurements with several aglycone substrates. The results indicated that residues H371, E379, D395 and Q396 (UGT1A6 numbering) are involved in UDPGA binding. The effects of the mutations on the glucuronidation rate were substrate- and isoform-dependent. UGTs belong to the GT1 family of glycosyltransferases. Many enzymes in this family use a serine protease-type catalytic mechanism, where histidine and aspartate form a “catalytic dyad”. Such a pair in human UGT1A9 could be H37 and either D143 or D148. Histidine 37 is not totally conserved among human UGTs, being replaced by proline in UGT1A4 and leucine in UGT2B10. Both latter isoforms are more specialised in N-glucuronidation. The roles of H37, D143 and D148 were investigated in UGT1A9 by site-directed mutagenesis, single-point activity and kinetic measurements. H37 was shown to be more important in O- than in Nglucuronidation activity. D148 also played a different role in these two types of glucuronidation reactions. The results implied that H37-D143 is the catalytic dyad in UGT1A9, but could not exclude the possible role of D148 in this dyad.
Avainsanat: biokemia
Tekijänoikeustiedot: Julkaisu on tekijänoikeussäännösten alainen. Teosta voi lukea ja tulostaa henkilökohtaista käyttöä varten. Käyttö kaupallisiin tarkoituksiin on kielletty.


Tiedostot

Latausmäärä yhteensä: Ladataan...

Tiedosto(t) Koko Formaatti Näytä
thehuman.pdf 981.7KB PDF Avaa tiedosto
abstract.pdf 6.670KB PDF Avaa tiedosto

Viite kuuluu kokoelmiin:

Näytä kaikki kuvailutiedot