The role of cyclase-associated protein (CAP) in actin dynamics during cell motility and morphogenesis

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:ISBN:978-952-10-4572-1
Title: The role of cyclase-associated protein (CAP) in actin dynamics during cell motility and morphogenesis
Alternative title: Syklaasiin assosioituva proteiini (CAP) säätelee aktiini-tukirangan dynamiikkaa solujen liikkumisen ja morfogeneesin yhteydessä.
Author: Bertling, Enni
Other contributor: Helsingin yliopisto, biotieteellinen tiedekunta, bio- ja ympäristötieteiden laitos
Helsingfors universitet, biovetenskapliga fakulteten, institutionen för bio- och miljövetenskaper
University of Helsinki, Faculty of Biosciences, Department of Biological and Environmental Sciences, Division of Genetics
Institute of Biotechnology
Publisher: Helsingin yliopisto
Date: 2008-03-14
Language: en
Belongs to series: Dissertationes bioscientiarum molecularium Universitatis Helsingiensis in Viikki - URN:ISSN:1795-7079
URI: http://urn.fi/URN:ISBN:978-952-10-4572-1
http://hdl.handle.net/10138/22132
Thesis level: Doctoral dissertation (article-based)
Abstract: The highly dynamic remodeling of the actin cytoskeleton is responsible for most motile and morphogenetic processes in all eukaryotic cells. In order to generate appropriate spatial and temporal movements, the actin dynamics must be under tight control of an array of actin binding proteins (ABPs). Many proteins have been shown to play a specific role in actin filament growth or disassembly of older filaments. Very little is known about the proteins affecting recycling i.e. the step where newly depolymerized actin monomers are funneled into new rounds of filament assembly. A central protein family involved in the regulation of actin turnover is cyclase-associated proteins (CAP, called Srv2 in budding yeast). This 50-60 kDa protein was first identified from yeast as a suppressor of an activated RAS-allele and a factor associated with adenylyl cyclase. The CAP proteins harbor N-terminal coiled-coil (cc) domain, originally identified as a site for adenylyl cyclase binding. In the N-terminal half is also a 14-3-3 like domain, which is followed by central proline-rich domains and the WH2 domain. In the C-terminal end locates the highly conserved ADP-G-actin binding domain. In this study, we identified two previously suggested but poorly characterized interaction partners for Srv2/CAP: profilin and ADF/cofilin. Profilins are small proteins (12-16 kDa) that bind ATP-actin monomers and promote the nucleotide exchange of actin. The profilin-ATP-actin complex can be directly targeted to the growth of the filament barbed ends capped by Ena/VASP or formins. ADF/cofilins are also small (13-19 kDa) and highly conserved actin binding proteins. They depolymerize ADP-actin monomers from filament pointed ends and remain bound to ADP-actin strongly inhibiting nucleotide exchange. We revealed that the ADP-actin-cofilin complex is able to directly interact with the 14-3-3 like domain at the N-terminal region of Srv2/CAP. The C-terminal high affinity ADP-actin binding site of Srv2/CAP competes with cofilin for an actin monomer. Cofilin can thus be released from Srv2/CAP for the subsequent round of depolymerization. We also revealed that profilin interacts with the first proline-rich region of Srv2/CAP and that the binding occurs simultaneously with ADP-actin binding to C-terminal domain of Srv2/CAP. Both profilin and Srv2/CAP can promote nucleotide exchange of actin monomer. Because profilin has much higher affinity to ATP-actin than Srv2/CAP, the ATP-actin-profilin complex is released for filament polymerization. While a disruption of cofilin binding in yeast Srv2/CAP produces a severe phenotype comparable to Srv2/CAP deletion, an impairment of profilin binding from Srv2/CAP results in much milder phenotype. This suggests that the interaction with cofilin is essential for the function of Srv2/CAP, whereas profilin can also promote its function without direct interaction with Srv2/CAP. We also show that two CAP isoforms with specific expression patterns are present in mice. CAP1 is the major isoform in most tissues, while CAP2 is predominantly expressed in muscles. Deletion of CAP1 from non-muscle cells results in severe actin phenotype accompanied with mislocalization of cofilin to cytoplasmic aggregates. Together these studies suggest that Srv2/CAP recycles actin monomers from cofilin to profilin and thus it plays a central role in actin dynamics in both yeast and mammalian cells.Kaikista aitotumallisista soluista löytyvä solutukiranka koostuu erilaisista säikeisistä proteiineista, jotka täyttävät solun sisäisen tilan ylläpitäen solun muotoa ja auttaen solua kestämään mekaanista rasitusta. Eräs keskeinen solutukirangan proteiini on nimeltään aktiini. Aktiinilla muodostaa säikeitä, jotka samanaikaisesti kasvavat niin sanotuista plus- ja hajoavat vastakkaisista miinus-päistä. Liikkumattomassa hiivasolussa aktiini-säikeillä on tärkeä tehtävä endosytoosissa, kalvorakkuloiden kuljetuksessa solun sisällä sekä solunjakautumisessa. Eläinsoluissa aktiini osallistuu näiden toimintojen lisäksi solun liikkumiseen. Solun työntyessä eteenpäin kasvavat aktiini-säikeiden plus-päät painavat solukalvoa eteenpäin. Säädelläkseen aktiinitukirangan muutoksia, solulla on laaja kirjo aktiinia sitovia proteiineja. Nämä proteiinit aikaansaavat mm. aktiini-säikeiden rakentumista, hajoamista, haaroittumista ja kiinnittymistä toisiinsa. Näitä ilmiöitä on tutkittu paljon, mutta siitä, miten aktiini-monomeerit saadaan ohjattua kasvaviin aktiini-säikeiden päihin, tiedetään hyvin vähän. Yksi keskeinen aktiinin kierrätykseen osallistuva proteiini on nimeltään syklaasiin assosioituva proteiini, CAP (cyclase-associated protein). Hiivan vastaavasta proteiinista käytetään nimeä Srv2/CAP. CAP proteiinit painavat noin 50-60 kilodaltonia ja koostuvat useista toiminnallisista domeenista. Proteiinin amino-terminaalisessa päässä sijaitsee cc(coiled-coil)-domeeni, jota seuraa 14-3-3-domeeni. Tämän jälkeen proteiinissa on kaksi proliini-rikasta aluetta sekä WH2-domeeni. Karboksi-terminaalisessa domeenissa sijaitsee aiemmin karakterisoitu konservoitunut ADP-aktiinin sitomisalue. Tässä väitöskirjatyössä tutkittiin kahden tunnetun aktiinia sitovan proteiinin, profiliinin ja ADF/kofiliinin, sitoutumista Srv2/CAP:iin, sekä niiden yhteistyötä aktiini-tukirangan dynamiikassa. Profiliinit ovat pieniä (12-15 kDa) ATP-aktiinia sitovia proteiineja, joilla on tärkeä tehtävä aktiiniin sitoutuneen nukleotidin, ADP:n, vaihtamisessa ATP-muotoon. ADF/kofiliinit ovat myös pieniä (13-19 kDa), konservoituneita proteiineja, jotka sitoutuvat voimakkaasti ADP-aktiiniin ja hajottavat aktiinisäikeitä. Tutkimuksessa saimme selville Srv2/CAP:in sitoutuvan suoraan hiivan kofiliiniin, mutta vain, jos tähän on sitoutuneena myös ADP-aktiini. Tuloksemme viittaavat siihen, että tämän jälkeen Srv2/CAP:n karboksi-terminaalinen aktiinia sitoa alue kilpailee ADP-aktiinin kofiliinilta. Koska Srv2/CAP sitoutuu hyvin heikosti pelkkään kofiliiniin, tämä todennäköisesti irtoaa kompleksista ja on taas vapaana toistamaan omaa tehtäväänsä. Totesimme myös profiliinin sitoutuvan Srv2/CAP:in ensimmäiseen proliini-rikkaaseen alueeseen samanaikaisesti kun ADP-aktiini on sitoutuneena Srv2/CAP:iin. Aktiinin nukleotidi vaihdetaan ATP:ksi, joko profiliinin tai Srv2/CAP:n toimesta. Profiliini sitoutuu voimakkaasti ATP-aktiiniin ja irtoaa Srv2/CAP:stä. Vapautuvia Profiliini-ATP-aktiini komplekseja käytetään solussa kontrolloituun aktiini-säikeiden kasvuun. Kofiliinin sitomisen poistaminen Srv2/CAP:sta aiheuttaa hiivassa vakavan fenotyypin, johon liittyy ongelmia mm. solun kasvussa ja aktiinirakenteiden muodostumisessa. Tästä voi päätellä kofiliinin sitomisen olevan hyvin keskeinen ominaisuus Srv2/CAP:in toiminnalle. Tutkimuksissamme hiiren CAP proteiineilla, CAP1:llä ja CAP2:lla, havaitsimme CAP2:n ilmentymisen rajoittuvan lihassoluihin, kun taas CAP1 ilmentyi kaikissa muissa solutyypeissä. CAP1:in poistaminen hiiren melanoomasoluista aiheutti kofiliinin kasaantumisen aktiinin kanssa epänormaaleihin kerääntymiin. Nämä tutkimukset osoittavat CAP:in olevan keskeinen komponentti kofiliinin ja aktiinin kierrätyksessä niin hiiva- kuin eläinsoluissakin.
Subject: solubiologia
Rights: Julkaisu on tekijänoikeussäännösten alainen. Teosta voi lukea ja tulostaa henkilökohtaista käyttöä varten. Käyttö kaupallisiin tarkoituksiin on kielletty.


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
theroleo.pdf 1.721Mb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record