Cellular Regulation of Glial Cell Line-Derived Neurotrophic Factor

Visa fullständig post

Permalink

http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-51-3950-4
Titel: Cellular Regulation of Glial Cell Line-Derived Neurotrophic Factor
Author: Lume, Maria
Medarbetare: Helsingfors universitet, bio- och miljövetenskapliga fakulteten, biovetenskapliga institutionen
Nivå: Doktorsavhandling (sammanläggning)
Tillhör serie: URN:ISSN:2342-317X
Abstrakt: Neurotrophic factors are small secretory proteins with important functions both in the nervous system and in peripheral tissues. Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) is best known for its ability to support the survival of midbrain dopaminergic neurons and enteric neurons. Also, GDNF is essential for the development of kidney and testis. It has been shown that both the absence and excessive amounts of GDNF protein negatively regulate kidney morphogenesis, highlighting the importance of proper spatiotemporal regulation of GDNF. Despite the wealth of knowledge regarding GDNF functions both in and outside the nervous system, relatively little is known about the trafficking mechanisms of GDNF. GDNF is synthesized as a precursor protein, proGDNF. In this thesis, we characterized the cellular localization and secretion of two GDNF splice variants, pre-(α)pro-GDNF and pre-(β)pro-GDNF, that differ in their pro-regions. Both precursor forms were shown to be secreted from cell lines. However, while (α)pro-GDNF co-localized mainly with the Golgi markers, the (β)pro-GDNF was found primarily in the secretogranin-II positive vesicles of the regulated secretory pathway. In accordance, the two splice isoforms responded differently to KCl-induced depolarization that is known to trigger the secretion of neurotrophin family members in neuronal cells. Only (β)pro-GDNF and corresponding mature GDNF were secreted activity-dependently, whereas (α)pro-GDNF and its corresponding mature GDNF were secreted via the constitutive secretory pathway. In addition, we determined which enzymes are responsible for the proteolytic cleavage of proGDNF into mature GDNF. To elucidate, whether secreted proGDNF has any biological activity, the recombinant cleavage-resistant proGDNF mutant protein was expressed in mammalian CHO cells and next purified from the media. Our results demonstrate that proGDNF is biologically active. Furthermore, similarly to mature GDNF, proGDNF can signal via the GDNF receptor α1/RET receptor tyrosine kinase complex and activate downstream MAPK and AKT pathways. Interestingly, proGDNF is not able to activate RET via the GFRα2 receptor. Finally, we identified a novel sorting receptor for GDNF and its receptors. Our results show that SorLA, a member of the vacuolar protein sorting 10-p domain receptor family, can internalize GDNF and GFRα1. While GDNF is subsequently degraded in lysosomes, GFRα1 is recycled back to the cell membrane. In the presence of SorLA and GFRα1, also RET is internalized and directed to early endosomes. By regulating the availability of GDNF and its co-receptors, SorLA can inhibit GDNF-induced neurotrophic activity in SY5Y cells. Moreover, SorLA seems to regulate intracellular localization of GFRα1 in hippocampal neurons. In summary, results of this thesis characterize the cellular regulation of GDNF regarding its secretion, processing, internalization and subsequent degradation. Furthermore, this is the first time that biological functions of the GDNF precursor protein proGDNF are described. Our findings indicate that the trafficking of GDNF is very different from that of other neurotrophic factors, and in contrast to apoptotic proneurotrophins, proGDNF is a trophic protein with increased specificity to GDNF receptor complex GFRα1-RET.Hermokasvutekijät ovat pieniä solun erittämiä proteiineja, joilla on tärkeä rooli sekä hermostossa että muissa kudoksissa. Gliasolulinjaperäinen hermokasvutekijä (GDNF) on parhaiten tunnettu siitä, että se säätelee keskiaivojen dopamiinisolujen sekä suoliston hermosolujen elonjäämistä. GDNF:llä on tärkeä rooli myös munuaisten ja siittiösolujen kehityksen säätelyssä. Aikaisemmissa kokeissa on osoitettu, että ainakin munuaisten kehityksessä GDNF:n tarkka määrä on kriittistä, sillä sekä liian matala tai liian korkea proteiinipitoisuus aiheuttaa munuaisten kehityshäiriöitä. Vaikka GDNF:n tehtävät tunnetaan melko hyvin, sen solunsisäisiä säätelymekanismeja ei ole tutkittu yksityiskohtaisesti. Aitotumalliset solut tuottavat erittyviä proteiineja usein pre-pro-mature muodossa. Pre-sekvenssin avulla proteiini ohjataan eritysreitille, pro-alueen tarkkaa roolia ei tunneta, mutta sen on ehdotettu vaikuttavaan proteiinin oikeaan laskostumiseen, kuljetukseen sekä biologiseen aktiivisuuteen. Mature eli kypsä alue koodaa biologisesti aktiivista proteiinia. Tämän väitöskirjatyön tarkoituksena oli selvittää miten GDNF-proteiinin eri muotoja eritetään solusta, onko prekursoriproteiini pro-GDNF biologisesti aktiivinen ja miten GDNF-proteiinin hajottaminen on säädelty soluissa. Tutkimme tarkemmin kahta GDNF:n muotoa (pre-(α)pro-GDNF ja pre-(β)pro-GDNF), joiden pro-alueet ovat eripituisia. Tutkimustuloksemme osoittivat, että pidempi pre-(α)pro-GDNF erittyy soluista jatkuvasti, lyhyempi pre-(β)pro-GDNF taas erittyy aktiivisuusriippuvaisesti. Lisäksi selvitimme mitkä proteinaasit pilkkovat pro-alueen GDNF-proteiinista. Työssäni osoitettiin myös, että mutantti (α)pro-GDNF prekursoriproteiini, joka ei altistu proteinaaseille, erittyy hyvin soluista pro-muodossa, on biologisesti aktiivinen ja kypsän GDNF:n tavoin suojaa sympaattisia hermosoluja kuolemalta. Kokeissa löydettiin myös vaihtoehtoinen GDNF:n reseptori SorLA, joka edesauttaa GDNF:n kuljettamista solun pinnalta lysosomeihin - soluorganelleihin, joissa GDNF-proteiini hajotetaan. Tutkimustuloksemme tuovat lisää tietoa GDNF:n solunsisäisistä säätelymekanismeista ja pro-GDNF:n biologisesta aktiivisuudesta. Tämä tieto voi olla hyödyllistä, kun suunnitellaan GDNF:n käyttöä esimerkiksi geeniterapiassa.
Permanenta länken (URI): URN:ISBN:978-951-51-3950-4
http://hdl.handle.net/10138/230242
Datum: 2018-01-12
Subject:
Rights: Publikationen är skyddad av upphovsrätten. Den får läsas och skrivas ut för personligt bruk. Användning i kommersiellt syfte är förbjuden.


Filer under denna titel

Total number of downloads: Loading...

Filer Storlek Format Granska
cellular.pdf 26.88Mb PDF Granska/Öppna

Detta dokument registreras i samling:

Visa fullständig post