Effect of PREP-modifications on autophagy

Abstract

Autophagy is a pathway for cells to degrade intracellular components that are no longer needed or are detrimental for the cells. It is essential for cell homeostasis and survival and has been related to various diseases and pathophysiology. Autophagy is a complex process and there are still several unclear und unknown aspects to it. Regulation of autophagy is essential to prevent unwanted and escess activation, and several pathways and molecules, both stimulatory and inhibitory, are included. Different signaling pathways are sensitive to a variety of environmental clues. Two main autophagy pathways are mTOR-dependent pathway and mTOR-independent pathway. Induction of autophagy in the latter pathway is dependent on the interaction of Bcl-2 and Beclin 1. Prolyl oligopeptidase (PREP) is a peptidase enzyme that has several substrates. PREP-inhibition by KYP-2047 can reduce aggregation of α-synuclein in two ways: by increasing rate of autophagy and by decreasing dimerization. The aim of this study was to find out how PREP affects the interaction between Bcl-2 and Beclin 1 and how this affects autophagy. Based on previous studies, PREP-inhibition seems to increase the amount of Beclin 1 and to affect the phosphorylation of Bcl-2 and Beclin 1, leading to dissociation of the complex. Hypothesis was to see differences in colocalization of Bcl-2 and Beclin 1 in cells treated with different PREP-modifications and for PREP-inhibition to decrease the colocalization. Human embryonic kidney cells 293 (HEK-293) and hPREP knockout cell line created from them by using CRISPR/Cas9-silencing were used in the experiments. Two experiments were performed on regular HEK-cells: inhibitor experiment with KYP-2047 (1 or 10 µM) and overexpression experiment (transfection with either active or inactive hPREP plasmid). After immunofluorescence staining, cells were analysed with confocal microscope and colocation analysis of Bcl-2 and Beclin 1 was performed. The intensity of Beclin 1 in the nuclei was stronger than in other parts of the cell in all samples, which could indicate a stronger activity of its nuclear tasks compared to autophagy. However, the antibody used for immunofluorescence has most likely caused this staining pattern. Based on previous knowledge, it was expected to see differences in colocalization of Bcl-2 and Beclin 1 in cells treated with different PREP-modifications. However, there were no significant differences in colocalization of Beclin 1 and Bcl-2 in any of the experiments but it was nearly 100 percent in all treatments. Since rate of autophagy in cells was not detected, it is impossible to determine, if there were changes in autophagy that were not reflected as changes in colocalization of these two proteins. It is possible that even a small change in colocalization can affect the rate of autophagy or there might be subpopulations where the interaction is interrupted and these changes are so small that they are not detectable with the methods used in this experiment. Both Bcl-2 and Beclin 1 also have functions not related to autophagy, which could be one reason behind the results gained in this study.

Autofagian avulla solut hajottavat solunsisäisiä komponentteja, joita ei enää tarvita tai jotka ovat haitallisia soluille. Se on tärkeää solujen homeostaasin ja selviytymisen kannalta, ja autofagia on yhdistetty useisiin sairauksiin ja patofysiologiaan. Autofagia on monimutkainen prosessi, johon liittyy useita epäselviä ja tuntemattomia näkökohtia. Autofagian säätely on olennaista epätoivotun ja liiallisen aktivaation välttämiseksi ja siihen osallistuu useita signaalinvälitysreittejä ja molekyylejä, sekä aktivoivia että estäviä. Eri säätelyreitit ovat herkkiä erilaisille ympäristön signaaleille. Kaksi tärkeintä autofagiareittiä ovat mTOR-riippuvainen ja -riippumaton säätelyreitti. Jälkimmäisessä säätelyreitissä autofagian induktio riippuu Bcl-2:n ja Beclin 1:n vuorovaikutuksesta. Prolyylioligopeptidaasi (PREP) on peptidaasientsyymi, jolla on useita substraatteja. Sen inhibitio KYP-2047-molekyylillä voi vähentää α-synukleiinin aggregaatiota joko lisäämällä autofagiaa tai vähentämällä dimerisaatiota. Tämän työn tarkoitus oli selvittää miten PREP vaikuttaa Bcl-2:n ja Beclin 1:n väliseen vuorovaikutukseen ja mitä vaikutuksia sillä on autofagiaan. Edellisten tutkimusten perusteella, PREP-inhibitio näyttäisi lisäävän Beclin 1:n määrää ja vaikuttaa Bcl-2:n ja Beclin 1:n fosforylaatioon ja siten niiden muodostaman kompleksin hajoamiseen. Hypoteesina oli löytää eroja Bcl-2:n ja Beclin 1:n kolokalisaatiossa eri PREP-modifikaatioilla käsitellyissä soluissa ja oletettiin PREP-inhibition lisäävän kolokalisaation määrää. Kokeissa käytettiin HEK-293-soluja (human embryonic kidney cells 293) ja niistä CRISPR/Cas9-menetelmän avulla tehtyä hPREP poistogeenistä solulinjaa. Tavallisilla HEK-soluilla tehtiin kaksi koetta: inhibiittorikoe KYP-2047-molekyylillä (1 tai 10 µM) ja yliekspressiokoe (transfektio joko aktiivisella tai inaktiivisella hPREP-plasmidilla). Soluille tehtiin immunofluoresenssivärjäys, jonka jälkeen ne kuvattiin konfokaalimikroskoopilla ja tehtiin Bcl-2:n ja Beclin 1:n kolokalisaatioanalyysi. Beclin 1:n intensiteetti tumissa oli voimakkaampi kuin solun muissa osissa kaikissa näytteissä. Tämä voi viitata esim. siihen, että sen tumansisäiset tehtävät ovat autofagiaa aktiivisempia. Todennäköisesti kuitenkin immunofluoresenssivärjäyksessä käytetty vasta-aine on aiheuttanut havaitun värjäytymismallin. Edellisten tutkimusten perusteella odotettiin, että eri PREP-modifikaatioilla käsiteltyjen solujen välillä on eroa Bcl-2:n ja Beclin 1:n kolokalisaatiossa. Merkittäviä eroja kolokalisaatiossa ei kuitenkaan havaittu missään koeasetelmassa vaan kolokalisaatio oli lähes 100 prosenttia kaikissa näytteissä. Autofagian määrää soluissa ei mitattu, joten on mahdoton määrittää, oliko autofagian määrässä muutoksia, jotka eivät ole näkyneet muutoksina kolokalisaatiossa. On mahdollista, että jopa pieni muutos kolokalisaatiossa vaikuttaa autofagian määrään tai Bcl-2- ja Beclin 1-proteiineilla voi olla alapopulaatioita, joissa niiden välinen vuorovaikutus on häiriintynyt ja nämä muutokset ovat niin pieniä, ettei niitä voi havaita tässä tutkimuksessa käytetyillä menetelmillä. Molemmilla proteiineilla on soluissa myös autofagiaan liittymättömiä tehtäviä, jotka saattavat vaikuttaa tässä tutkimuksessa saatuihin tuloksiin.