Whey protein oxidation: LC-MS investigations of peptide markers

Näytä kaikki kuvailutiedot

Permalink

http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-51-4065-4
Julkaisun nimi: Whey protein oxidation: LC-MS investigations of peptide markers
Tekijä: Koivumäki, Tuuli
Muu tekijä: Helsingin yliopisto, maatalous-metsätieteellinen tiedekunta, elintarvike- ja ympäristötieteiden laitos
Opinnäytteen taso: Väitöskirja (artikkeli)
Tiivistelmä: Milk whey proteins, especially α-lactalbumin and β-lactoglobulin, are valuable to human nutrition due to their excellent amino acid composition. For this reason, they are also favored by sports nutrition industry. In food products, proteins often constitute with a desired technological function, such as their water-binding, foaming and emulsifying properties. Oxidative deterioration of proteins alters these properties, and can occur during processing and storage. Perhaps even more importantly, oxidation of proteins can lead to their compromised bioavailability and loss of nutritive value, if the so called essential amino acid residues are affected. In order to evaluate the oxidation status and quality of food proteins, versatile analytical tools are needed. The currently available methods, also used in milk studies, include a very general spectrophotometric measurement of carbonyl compounds which are typically formed by many oxidation reactions. However, the milk whey proteins are particularly rich in amino acids such as cysteine, methionine, tryptophan and tyrosine, which are all known to produce oxidation products other than carbonyl form. More accurate tools are needed to allow a better fit for the different types of proteins, and to expand the understanding of site-specific oxidation reactions. The purpose of this dissertation study was to establish a novel protocol for the investigation of protein oxidation via peptides produced by trypsin digestion. The proteins used in the study were α-lactalbumin and β-lactoglobulin, the two main ingredients of bovine milk whey. The selected peptides were chosen based on their amino acid composition containing at least one residue known to be oxidatively prone. Fractionation was achieved with a developed preparative-HPLC-MS method, and the collected peptides were oxidized individually in metal-catalyzed oxidation (MCO with Fenton chemistry) conditions for 14 days in +37 °C. Furthermore, LC–ESI-QIT-MSn methods including UV/VIS and fluorescence detectors, were created to investigate the site-specific oxidation modifications in the studied peptides. The results gathered in this study showed that carbonyl formation was often secondary to other amino acid oxidation modifications in the chosen peptides. Only 50% of the included lysine residues were observed to oxidize into the most typical carbonyl form, whereas all of the studied methionine residues as well as most tryptophan and cysteine residues were found to be very prone to oxidize. In addition to the confirmed main target sites of MCO, this study proposes several promising peptides that could be used as markers of oxidation for monitoring the oxidative status of full whey proteins. Especially the proposed peptide markers formed from ALPMHIR and LIVTQTMK of β-lactoglobulin as well as LDQWLCEK and VGINYWLAHK from α-lactalbumin were considered highly potential. In addition, the created and proven analysis protocol provides a valuable basis for further investigations of food protein and peptide oxidation and interaction studies.Maidon heraproteiinit, erityisesti α-laktalbumiini ja β-laktoglobuliini, ovat ravitsemuksellisesti erinomaisia ja monipuolisia aminohappojen lähteitä. Siksi ne ovat suosittuja myös erilaisissa urheilijoiden lisäravinnevalmisteissa. Elintarvikkeissa proteiineilla on ravintoarvonsa lisäksi tärkeitä teknologisia tehtäviä, ja niitä voidaankin lisätä tarkoituksellisesti esimerkiksi parantamaan vaahtoutumista, sitomaan vettä tai emulgaattoreiksi. Hapettuminen on kemiallinen ilmiö, joka tunnetaan sekä tieteessä että kotikeittiöissä parhaiten rasvan reaktioina, ns. ”härskiintymisenä”. Myös proteiinit ovat alttiita hapettumaan, vaikka niiden lopputuotteita harvemmin havaitaankaan suoraan aistinvaraisesti virhemakuina tai värimuutoksina. Toisaalta hapettuminen voi olla myös haluttua, esimerkiksi tuotteen rakenteen muokkausta entsyymien avulla. Proteiinien ei-toivotun hapettumisen tärkeimmät seuraukset ovat hyväksikäytettävyyden ja ravitsemuksellisen arvon heikkeneminen, erityisesti mikäli hapettumista on tapahtunut ns. välttämättömissä aminohapoissa. Proteiinien laadun arviointiin tarvitaankin uusia työkaluja, sillä perinteisin hapetustuotteiden määritysmenetelmä perustuu vain hyvin yleispätevään karbonyylimuotoisten yhdisteiden spektrofotometriseen mittaukseen. Tämä menetelmä on kuitenkin erityisen epäedustava maidon heraproteiineille, joissa useat tyypilliset aminohapot kuten kysteiini, metioniini, tryptofaani ja tyrosiini voivat hapettuessaan tuottaa muitakin kuin karbonyyliyhdisteitä. Tämän väitöskirjatutkimuksen tavoitteena oli kehittää uusia nykyaikaisia määritysmenetelmiä heraproteiinien hapettumisen tutkimuksen avuksi, erityisesti nestekromatografia–massaspektrometriaa (LC–MS) hyödyntäen. Tutkimuksessa kehitettiin menettelytapa, jossa heraproteiinit hydrolysoitiin entsymaattisesti luonnollisella trypsiinillä, sekä syntyneet peptidit eroteltiin preparatiivisella kromatografialla ja kerättiin osafraktioikseen jatkotutkimuksiin. Näin eristettyjä peptideitä hapetettiin 14 vrk metallikatalysoiduissa olosuhteissa +37 °C:ssa ja osanäytteitä kerättiin 0, 1, 4, 7, 10 ja 14 vrk. Hapettumismuutosten tutkimuksen päätyökaluna käytettiin nestekromatografi–kvadrupoli-ioniloukku-massaspektrometria sähkösumutusionisaatiota käyttäen. Tunnistukset perustuivat moninkertafragmentaatiomassaspektrien lisäksi UV/VIS- ja fluoresenssi-ilmaisimilla kerättyyn tietoon. Tämän väitöskirjatyön tulokset osoittivat, että karbonyylimuotoiset hapettumistuotteet olivat todella useimmiten toissijaisia tutkittujen peptidien kaikista havaituista hapettumismuutoksista. Esimerkiksi lysiineistä vain 50 % hapettui tunnetuimpaan α-AAS-muotoonsa, jota on pidetty yhtenä tärkeimmistä hapettumisen merkkiyhdisteistä. Sen sijaan kaikki tutkittujen peptidien metioniinit sekä suurin osa tryptofaaneista ja kysteiineistä olivat erittäin alttiita hapettumaan, muodostaen tuotteita joita karbonyylimääritys ei havaitse. Näiden yksittäisten tyypillisten hapettumiskohteiden tunnistamisen lisäksi väitöskirjatyön tuloksena ehdotetaan useita peptideitä, joiden hapettumisen tilaa voitaisiin seurata ns. kohdennettuina ja edustavina merkkiyhdisteinä kokonaisten heraproteiinien ravitsemuksellisen laadun arvioinnissa.
URI: URN:ISBN:978-951-51-4065-4
http://hdl.handle.net/10138/232240
Päiväys: 2018-03-03
Avainsanat:
Tekijänoikeustiedot: Julkaisu on tekijänoikeussäännösten alainen. Teosta voi lukea ja tulostaa henkilökohtaista käyttöä varten. Käyttö kaupallisiin tarkoituksiin on kielletty.


Tiedostot

Latausmäärä yhteensä: Ladataan...

Tiedosto(t) Koko Formaatti Näytä
Wheyprot.pdf 1.707MB PDF Avaa tiedosto

Viite kuuluu kokoelmiin:

Näytä kaikki kuvailutiedot