Non-linear Label-free Optical Imaging of Cells, Nanocrystal Cellular Uptake and Solid-State Analysis in Pharmaceutics

Show full item record

Permalink

http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-51-4056-2
Title: Non-linear Label-free Optical Imaging of Cells, Nanocrystal Cellular Uptake and Solid-State Analysis in Pharmaceutics
Author: Saarinen, Jukka
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Pharmacy, Farmaseuttinen kemia ja teknologia
Thesis level: Doctoral dissertation (article-based)
Abstract: In the pharmaceutical industry, novel analytical techniques are required to gain important insights about new drug candidates and their formulations as early as possible. This information can be used to develop more efficient, safe and also economically profitable medicines. Microscopy techniques can be used for example to follow the fate of nanoparticles in cells and tissues, but also to monitor the changes in solid-state forms of drug molecules during drug development and storage. The overall aim of the Thesis was to evaluate the capability of non-linear optical imaging, especially coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS), second harmonic generation and sum-frequency generation (SHG and SFG) microscopies, in pharmaceutical applications including imaging of live cells, nanoparticle cellular uptake and pharmaceutical solid-state analysis. First, the capability of CARS microscopy to image live cell cultures on pharmaceutically relevant membrane inserts was evaluated. It was found that, label-free CARS microscopy can be used to image Caco-2 cells (used in drug permeation studies) grown on PTFE inserts in a non-destructive manner. Label-free CARS microscopy could probe lipid droplets and the size of lipid droplets increased substantially over a 21- day culturing period, which is important in the context of drug permeation studies, since lipid content of the cells will influence drug permeation. Next, CARS microscopy was successfully used to probe non-fluorescent nanocrystals in cells in a label-free and chemically-specific manner. In addition, electron microscopy could be used to visualize the subcellular location of nanocrystals in cells with nanometer spatial resolution in a chemically-specific manner by using a developed correlative imaging method with CARS and EM. At the end, multimodal CARS and SHG/SFG imaging was used to visualize the distribution and crystallization of indomethacin and its solid states on tablet surfaces. The combined use of two imaging modalities is beneficial, since data provided by using two techniques relying on different mechanisms (detection of molecular vibrations (CARS) and SFG signal produced by non-centrosymmetric crystals), can support each other. In summary, it was demonstrated that non-linear optical imaging can be a very useful tool in pharmaceutical applications including imaging of live cells, nanoparticle cellular uptake and solid-state analysis. The results were obtained by using a commercially available microscope, which suggests that there is plenty of potential in these techniques to be applied on a wider scale. The use of these techniques is likely to increase with further instrument commercialization in the near future.Väitöskirjassa tutkittiin epälineaaristen mikroskooppitekniikoiden soveltuvuutta farmasian tutkimuksissa. Erityisesti tutkittiin, soveltuvuutta elävien solujen kuvauksessa, sekä nanopartikkeleiden soluun kulkeutumista. Lisäksi tutkittiin menetelmien soveltuvuutta lääkeaineen kiinteä tilan analysoinnissa. Epälineaariset mikroskooppitekniikat, kuten Cars- mikroskopia ja ns. Sfg- mikroskopia ovat tekniikoita, joilla voidaan kuvata kemikaalispesifisesti näytettä ilman lisättyjä merkkiaineita, toisin kuin esim. fluoresenssimikroskoopilla. Nykyisessä lääkkeenkehitysprosessissa suositaan innokkaasti nanopartikkeleita. Näiden avulla voidaan esim. saada aikaan kohdennettu lääkkeenkuljetus esim. syöpäsoluihin. Mikroskooppimenetelmillä voidaan tutkia kulkeutuvatko nanopartikkelit haluttuun paikkaan esim. solujen sisälle. Uudet lääkeainemolekyylit ovat usein niukkaliukoisia. Liukoisuutta ja imeytymistä elimistöstä voidaan parantaa käyttämällä lääkeaineen amorfisia muotoja. Tällöin lääkeainemolekyylit eivät ole järjestäytyneet selväksi kiderakenteeksi, toisin kuin kiteisillä aineilla. Amorfiset muodot pyrkivät kuitenkin kiteytymään esim. prosessoinnin tai säilyvyyden aikana. Tällä voi olla suuria vaikutuksia lääkkeen vaikutuksen kannalta. Epälineaarisilla mikroskooppimenetelmillä voidaan varmistaa lääkemolekyylin kiinteä tila. Solukuvauksessa Cars- mikroskopia osoittautui hyväksi menetelmäksi. Eläviä soluja kuvattiin kemikaalispesifisesti ilman ulkoisia merkkiaineita ja vaurioittamatta soluja. Caco-2 soluja käytetään mallintamaan ohutsuolen epiteelisolukkoa. Caco-2 soluissa havaittiin ns. lipidipisaroita (lipid droplet). Nämä pisarat kasvoivat kolmen viikon tarkastelujakson aikana paljon. Löydöt selittävät osaltaan lääkeaineiden imeytymiskokeiden tulosten vaihteluita. Lisäksi Cars- mikroskopialla pystytiin osoittamaan että, solut (RAW 264.7 makrofagi) olivat ottaneet sisään nanokiteitä. Tutkimustulos, että nanokiteitä voidaan kuvata solujen sisältä ilman väriaineita Cars- mikroskoopilla, on merkittävä, sillä nanopartikkeleiden käyttö lääkkeen kehityksessä on lisääntymässä. Lisäksi, Cars- mikrosopia yhdistettynä Sfg- mikroskopiaan osoittautui oivaksi menetelmäksi myös kuvattaessa indometasiini- lääkeaineen erilaisia kiinteän tilan muotoja tabletin pinnasta. Menetelmällä pystyttiin seuraamaan tabletin pinnan kiteytymistä hyvällä herkkyydellä. Yhteenvetona voidaan todeta, että väitöskirjassa osoitettiin, että epälineaariset mikroskooppimenetelmät soveltuvat hyvin farmaseuttisiin tutkimuksiin. Odotettavissa on, että laitteiden yleistyessä lääkkeen kehitys prosessissa voidaan hyödyntää näitä menetelmiä monipuolisesti.
URI: URN:ISBN:978-951-51-4056-2
http://hdl.handle.net/10138/233089
Date: 2018-03-02
Subject:
Rights: This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
Nonlinea.pdf 17.16Mb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record