Development of Analytical Tools for the Quantification of MANF and CDNF in Disease and Therapy

Näytä kaikki kuvailutiedot

Permalink

http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-51-4557-4
Julkaisun nimi: Development of Analytical Tools for the Quantification of MANF and CDNF in Disease and Therapy
Tekijä: Galli, Emilia
Muu tekijä: Helsingin yliopisto, farmasian tiedekunta
Lääketutkimuksen tohtoriohjelma
Opinnäytteen taso: Väitöskirja (artikkeli)
Kuuluu julkaisusarjaan: Dissertationes Scholae Doctoralis ad Sanitatem Investigandam Universitatis Helsinkiensis - URN:ISSN:2342-317X
Tiivistelmä: Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor (MANF) and cerebral dopamine neurotrophic factor (CDNF) are expressed ubiquitously in the body and show protective effects on neurons and other cell types. Although the effects of MANF and CDNF administration have been studied in various animal disease models, such as neurodegenerative diseases, ischemia, and diabetes, it is largely unknown whether their endogenous levels and expression patterns are changed in relation to the pathology of these diseases. This thesis describes the development and validation of enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) for the specific and sensitive quantification of MANF and CDNF in biological samples including serum, tissues, and in vitro cell samples. Since MANF removal leads into a clear diabetic phenotype in mice, we studied the circulating MANF levels in relation to human type 1 diabetes. The aim was to find out whether MANF expression and/or secretion is differently regulated before and at the onset of clinical symptoms of the disease, thus giving insights into its association to type 1 diabetes development in humans. Multiple studies have demonstrated neuroprotective and neurorestorative effects of MANF and CDNF. Since they are unable to penetrate the blood brain barrier, they need to be delivered within the central nervous system. In this thesis, the effects of intracranial gene therapy of human CDNF were studied in animal models of Parkinson’s and Alzheimer’s disease. Transgene expression depends on multiple variables, such as transduction efficiency, stability, and virus titer. Thus, the quantification of expressed protein is important in the interpretation of its effects. The species-selectivity of the developed ELISAs was utilised when analysing human CDNF levels in rodent brain. In addition to gene therapy, long-term protein delivery can be implemented by encapsulated cells that secrete the therapeutic protein to the target site. The developed ELISAs were used for the quantification of secreted CDNF from cells. Despite the successful production of several cell clones with high CDNF expression, its secretion was found to decrease markedly once the cells were confluent in cell culture plates or in polymeric microcapsules. This thesis describes modifications that were done to the CDNF coding sequence to improve its secretion, aiming at efficient delivery of CDNF by encapsulated cell therapy. The developed sensitive, specific, and thoroughly validated ELISAs for the quantification of MANF and CDNF can be utilised in future studies aimed at understanding the regulation and functions of these proteins in health and disease. In addition, the ELISAs hold the potential for analysis of these proteins as biomarkers.Keskiaivojen astrosyyttiperäistä hermokasvutekijää (MANF) ja aivoperäistä dopamiinihermokasvutekijää (CDNF) ilmennetään laajalti kehossa ja niillä on osoitettu olevan hermo- ja muita soluja suojaava vaikutus. MANF:n ja CDNF:n hoitovaikutuksia on tutkittu eläimillä muun muassa hermorappeumatautien, iskemian ja diabeteksen tautimalleissa. Tällä hetkellä ei kuitenkaan tiedetä, liittyvätkö niiden ilmentymisen muutokset kyseisten tautien kehitykseen. Tämä väitöskirja kuvaa entsyymivälitteisten immunokemiallisten testien (ELISA) kehittämisen ja validoinnin MANF:n ja CDNF:n tasojen herkkään ja valikoivaan määrittämiseen biologisissa näytteissä, kuten seerumissa, kudoksissa ja soluviljelynäytteissä. Koska MANF:n poisto hiirillä johtaa tyypin 1 diabeteksen-kaltaiseen tilaan, tutkimme MANF:n seerumipitoisuuksia kyseisessä taudissa ihmisillä. Tavoitteenamme oli saada tietoa siitä, muuttuuko MANF:n ilmentyminen ja/tai erittyminen tyypin 1 diabeteksen oireiden puhkeamisen aikaan tai ennen sitä. Tulokset voisivat näin antaa viitteitä siitä, onko MANF yhteydessä taudin kehitykseen ihmisillä. Useat tutkimukset ovat osoittaneet MANF:n ja CDNF:n hermosoluja suojaavat ja korjaavat vaikutukset. Koska MANF ja CDNF eivät pysty läpäisemään veriaivoestettä, ne tulee annostella suoraan keskushermostoon. Tässä väitöskirjassa tutkitaan ihmisperäisen CDNF:n vaikutuksia Parkinsonin ja Alzheimerin tautimalleissa kallonsisäisessä geeniterapiassa jyrsijöillä. Siirtogeenin ilmentyminen riippuu monista muuttujista. Siksi ilmentyneen proteiinin tasojen määritys on tärkeää sen aikaansaamien muutosten tulkinnassa. Lajityypillisen CDNF:n täsmällinen mittaaminen kehitetyllä ELISA:lla mahdollisti ihmisperäisen CDNF:n valikoivan mittaamisen jyrsijöiden aivoissa. Proteiinien pitkäaikainen aivojensisäinen anto voidaan toteuttaa myös kapseloitujen, lääkinnällistä proteiinia erittävien solujen avulla. Kehitettyjä ELISA-menetelmiä käytettiin soluista erittyneen CDNF:n määrän mittaamiseen. Vaikka CDNF:ää vahvasti ilmentävien solukloonien tuotto onnistui hyvin, CDNF:n erittyminen soluista väheni huomattavasti kun ne olivat jakautumattomina joko kasvumaljoilla tai polymeerikapseleissa. Tämä väitöskirja kuvaa tehdyt muutokset CDNF:n koodaavan geenisekvenssin, jotka paransivat CDNF solusta erittymistä. Tässä työssä kehitettyjä herkkiä, spesifisiä ja perusteellisesti validoituja ELISA-määritysmenetelmiä voidaan käyttää tulevissa tutkimuksissa, kun halutaan selvittää MANF:n ja CDNF:n säätelyä ja toimintaa normaalissa terveydentilassa sekä erilaisissa sairauksissa. Lisäksi määritysmenetelmiä voidaan käyttää kyseisten proteiinien analysointiin mahdollisina biologisina merkkiaineina.
URI: URN:ISBN:978-951-51-4557-4
http://hdl.handle.net/10138/243247
Päiväys: 2018-10-13
Avainsanat:
Tekijänoikeustiedot: Julkaisu on tekijänoikeussäännösten alainen. Teosta voi lukea ja tulostaa henkilökohtaista käyttöä varten. Käyttö kaupallisiin tarkoituksiin on kielletty.


Tiedostot

Latausmäärä yhteensä: Ladataan...

Tiedosto(t) Koko Formaatti Näytä
DEVELOPM.pdf 2.587MB PDF Avaa tiedosto

Viite kuuluu kokoelmiin:

Näytä kaikki kuvailutiedot