Synthesis of lignanolactones, hapten derivatives and deuterium labelling studies

Abstract

Lignans are naturally occurring compounds, ubiquitous in edible plants. Some plant lignans metabolize in man forming mammalian lignans. Both plant and mammalian lignans have shown to possess several biological activity and the research interest in lignans has grown due to the possible health effects.

The literature review discusses the biosynthesis of plant lignans, their bioavailability from edible plants, metabolism in man and the health effects of lignans. Also the analytical methods for lignans are discussed and the synthetic approaches to lignanolactones, lignan haptens and labelled lignans are reviewed.

The experimental work focused on the synthesis of lignanolactones and lignanediols. Characterised lignanolactone reference molecules are needed for the analytical and metabolic studies of lignans. In this work eleven new lignano-9,9´-lactones and six lignano-9,9´-diols, possible metabolic products, were synthesised via the Michael-addition alkylation reaction. All the structures were fully characterised using MS, 1H NMR, 13C NMR and 2D NMR (HSQC, HMBC and COSY). The synthesised molecules were used as authentic reference materials and also for the deuteration study.

Eight lignanolactones were deuterated using D3PO4·BF3/D2O as the deuteration reagent to achieve stable D-labeled molecules. The aromatic protons of the lignans were exchanged in the deuteration reaction and labile deuteriums were back exchanged by treatment with MeOH/CH3COCl in order to form stable deuterated compounds. The meta-substituted hydroxy or methoxy groups activate the 2,4,6 aromatic sites which led to the back exchange. The isotopic purities of the stable deuterated molecules were determined by using MS and were found to be 85 - 99%. The deuteration reaction was studied in more detail by comparing the order of deuteration/dedeuteration, monitored with NMR, to the theoretically calculated ESP values of the aromatic protons. The observations and theoretical calculations were in good agreement. The orientation, the reactivity order and stability of deuterium labels in the lignan molecules were determined.

Four enterolactone haptens, namely 3’-O-carboxymethyl-ENL, 3-O-carboxymethyl-ENL, 5-carboxymethoxy-ENL and 5’-carboxymethoxy-ENL were synthesised in order to find good immunogens for the development of the ELISA analytical method for enterolactone. The reactions for 3-O-carboxymethyl-ENL and 5-carboxymethoxy-ENL were improved, and new haptens 3’-O-carboxymethyl-ENL and 5’-carboxymethoxy-ENL were fully characterised using MS, 1H NMR, 13C NMR and 2D NMR.

Lignaanit ovat laajalti luonnossa esiintyviä molekyylejä ja niitä on löydetty lukuisista kasveista ja kaikista kasvien osista. Lignaanien rooli kasveissa ei ole täysin selvä, mutta todennäköisesti ne ovat osa kasvien puolustusmekanismia ja suojaavat kasveja taudeilta, sieniltä ja tuholaisilta. Monet syötävät kasvit sisältävät paljon kasvilignaaneja ja toistaiseksi paras ravinnosta löydetty lignaanilähde on pellavansiemenet. Muita lignaanirikkaita ravintokasveja ovat mm. viljatuotteet ja etenkin kokojyvätuotteet, siemenet, pähkinät, suomalaiset marjat, tietyt hedelmät ja vihannekset, kuten esimerkiksi parsa. Monet kasvilignaanit muuntuvat eli metaboloituvat ihmisen suoliston bakteerien vaikutuksesta molekyyleiksi, joita kutsutaan enterolignaaneiksi. Yleisimmin enterolignaaneja on määritetty ihmisen virtsasta tai verestä. Enterolignaanien määrä vaihtelee suuresti ihmisissä johtuen mm. henkilön sukupuolesta ja iästä, ravinnosta, elämäntavoista sekä suoliston bakteerikannasta. Enterolignaaneja ja kasvilgnaaneja tutkitaan maailmanlaajuisesti johtuen niiden mahdollisista terveysvaikutuksista. Tutkimuksissa on raportoitu mm. virtsan korkean enterolignaanipitoisuuden ja alhaisen diabetesriskin sekä painon ja enterolignaanipitoisuuden yhteydet. Monissa tutkimuslaitoksissa tutkitaan myös enterolaktonipitoisuuden yhteyttä sydän- ja verisuonitauteihin sekä eräiden syöpien yhteyttä. Lignaanitutkimuksia varten käytetään nopeita ja tarkkoja analyysimenetelmiä. Tunnettuja molekyylejä tarvitaan vertailuaineina analysoitaessa ja tunnistettaessa lignaaneja kasveista, virtsasta ja verinäytteistä, sekä monissa erilaisissa tutkimuksissa kuten esimerkiksi metaboliatutkimuksissa. Väitöstyössä on keskitytty lignaanimolekyylien valmistamiseen (eli syntetiikkaan). Työssä on valmistettu seitsemäntoista uutta mahdollista enterolignaani- ja kasvilignaanimolekyyliä käyttäen Michael-additio alkylaatioreaktiota sekä todennettu kaikkien valmistettujen molekyylien rakenne. Kahdeksasta lignaanimolekyylistä on valmistettu happamissa olosuhteissa pysyvät deuteroidut johdannaiset (85-99% isotooppipuhtaus) sekä deuteroitumisreaktioita on tutkittu vertaamalla teoreettisia laskelmia ja käytännön huomioita reaktiosta. Lisäksi neljän enterolignaanin happojohdannaista valmistettiin ja rakenteet varmennettiin uuden analyysimenetelmän kehittämiseksi.