Suomalaisista sioista ja sianlihasta eristettyjen metisilliiniresistenttien Staphylococcus aureus -bakteerikantojen molekyyliepidemiologia kokogenomisekvensoinnilla

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-201811123520
Title: Suomalaisista sioista ja sianlihasta eristettyjen metisilliiniresistenttien Staphylococcus aureus -bakteerikantojen molekyyliepidemiologia kokogenomisekvensoinnilla
Author: Kaipainen, Suvi
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Biological and Environmental Sciences, Faculty of Biological and Environmental Sciences
Publisher: Helsingin yliopisto
Date: 2018
URI: http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-201811123520
http://hdl.handle.net/10138/277649
Thesis level: master's thesis
Abstract: Tutkielmassa tutkittiin suomalaisista sioista ja sianlihasta eristettyjen metisilliiniresistenttien Staphylococcus aureus CC398 -kantojen geneettisiä ominaisuuksia kokogenomisekvensoinnin avulla. Lisäksi kantojen fenotyyppistä mikrobilääkeherkkyyttä tutkittiin. Tutkimukseen valitut kannat (n=39) olivat peräisin Eviran kantakokoelmasta ja ne oli eristetty vuosina 2008-2017. Kannat olivat peräisin oireettomista ja infektoituneista suomalaisista sioista sekä suomalaisesta sianlihasta, ja ne edustivat neljää yleisintä Suomessa sioilla tavattua spa-tyyppiä (t034, t2741, t011 ja t108). Tutkimuksen alkuvaiheessa optimoitiin S. aureus -bakteerille parhaiten sopiva DNA-eristysmenetelmä vertailemalla automaattista DNA-eristysrobottia sekä manuaalista DNA-eristysmenetelmää keskenään. MRSA-kannoista eristetyt DNA-näytteet lähetettiin Saksaan, missä näytteet sekvensoitiin Illumina-sekvensointimenetelmällä. Lukusekvenssit koottiin bioinformatiikan ohjelmalla, joka hyödynsi kolmea erilaista algoritmiä: Spades, Idba ja Velvet. Koontisekvensseistä tunnistettiin mikrobilääkeresistenssi- ja virulenssigeenejä, plasmideja ja SCCmec-kasettityyppi sekä kannat tyypitettiin käyttäen bioinformatiikan ohjelmia. Kannoille oli määritetty spa-tyyppi jo aikaisemmin Evirassa PCR-menetelmällä, ja tyypityksen tuloksia verrattiin PCR-menetelmällä saatuihin tuloksiin. Koontisekvensseistä luotiin lisäksi fylogeneettinen puu CSI Phylogeny-ohjelmalla. Kantojen fenotyyppinen mikrobilääkeherkkyys määritettiin nestelaimennosmenetelmällä käyttäen mikrobilääkeherkkyyspaneelia. Vertailluista DNA-eristysmenetelmistä manuaalinen menetelmä osoittautui hieman paremmaksi, sillä se tuotti puhtaampaa DNA:ta jatkokäsittelyjä varten. Spades-algoritmi vaikutti sopivan parhaiten Illumina-menetelmällä sekvensoiduille näytteille, ja jatkoanalyyseissä päädyttiin käyttämään kyseisellä algoritmilla koottuja sekvenssejä. Kannoilta tunnistettiin vain niukasti virulenssigeenejä, ja monet ihmisen taudinaiheutuksen kannalta tärkeät geenit puuttuivat. Kaikilla kannoilla oli sama sioille tyypillinen SCCmec-kasettityyppi ja kannat kuuluivat samaan sioille yleiseen ST398-sekvenssityyppiin. Illumina-sekvensointi ja spa-tyypityksessä käytetty ohjelma eivät toimineet täydellisesti, sillä ohjelma ei erottanut spa-tyyppejä t034 ja t011 toisistaan. Tähän oli todennäköisesti syynä kyseisten spa-tyyppien toistojaksojen samankaltaisuus ja Illumina-sekvensointimenetelmän tuottamat lyhyet sekvenssipätkät, jotka aiheuttivat haasteita sekvenssien koonnille. Kaikki kannat olivat resistenttejä beetalaktaameille ja tetrasykliinille, mikä on MRSA CC398 -kannoille tyypillistä. Lisäksi resistenssi oli melko yleistä muun muassa klindamysiinille ja trimetopriimille. Mikrobilääkeresistenssi vaikutti olevan ainakin osittain plasmidivälitteistä, sillä kannoilta tunnistettiin plasmideja, joiden on kirjallisuudessa kuvailtu sisältävän tiettyjä resistenssigeenejä. Eri spa-tyyppien mikrobilääkeresistenssiprofiilit erosivat toisistaan, sillä tiettyä spa-tyyppiä olevilla kannoilla oli enemmän resistenssiä tietyille mikrobilääkkeille verrattuna toisiin spa-tyyppeihin. Fylogeneettisen analyysin perusteella tutkitut MRSA CC398 -kannat vaikuttivat olevan hyvin heterogeeninen ryhmä. Samaan spa-tyyppiin kuuluvat kannat olivat läheisintä sukua toisilleen, mikä oli odotettavissa. Sianlihasta ja sioista tunnistettiin samankaltaisia kantoja, mikä viittaa siihen, että sioista oli siirtynyt bakteereja lihaan. Oireettomista sioista ja infektoituneista sioista eristettyjen kantojen välillä ei havaittu merkittäviä eroja. Infektioita aiheuttavilla kannoilla ei ollut muita kantoja enemmän virulenssitekijöitä. Tutkimus antoi paljon uutta tietoa suomalaisista sioista ja sianlihasta eristettyjen MRSA CC398 -kantojen ominaisuuksista. Kantojen mikrobilääkeresistenssi, virulenssi ja muut tutkitut ominaisuudet olivat hyvin samankaltaisia verrattuna aikaisemmin kirjallisuudessa kuvailtuun. MRSA CC398 -kannat eivät vaikuttaneet olevan toistaiseksi erityisen virulentteja ihmisille, mutta tilannetta on kuitenkin tärkeä pitää silmällä lisääntyvän resistenssin ja virulenssin varalta. Paras keino estää MRSA-bakteerin leviäminen on vähentää bakteerin määrää sikatiloilla, joista se todennäköisimmin leviää sikatiloilla työskenteleviin ihmisiin ja ympäristöön ja edelleen muuhun väestöön.In this study 39 methicillin-resistant Staphylococcus aureus CC398 isolates from Finnish pigs and pork were sequenced by whole-genome sequencing. Also, phenotypic antimicrobial resistance of the strains was examined. The strains originated from the culture collection of Finnish Food Safety Authority (Evira) and they were isolated between the years of 2008 and 2017. MRSA strains were isolated from both asymptomatic and infected pigs and pork. The strains represented the four most common spa types in Finnish pigs (t034, t2741, t011 and t108). DNA extraction method for S. aureus was optimized by comparing automatic DNA extraction robot and manual DNA extraction method. Extracted DNA samples were sent to Germany to be sequenced with Illumina sequencing. Paired-end raw read sequences were assembled using three different algorithms: Spades, Idba and Velvet. The assembled sequences were analysed by bioinformatics tools. Possible antimicrobial resistance genes, virulence genes, plasmids and SCCmec cassettes were identified. The strains were also typed by spa typing and sequence typing. spa typing was already performed in Evira using PCR and the new spa typing results were compared to the PCR results. Using the assembled sequences, a phylogenetic tree was also constructed. Phenotypic antimicrobial susceptibility testing was performed using broth microdilution panel. The manual extraction method was slightly better since the extracted DNA was purer. The best assembly algorithm was Spades and because of that all sequences were assembled with that algorithm for further analyses. The strains carried only a few virulence genes and many genes that are important for human infection were missing. All the strains carried the same SCCmec cassette type and sequence type ST398 both of which are known to be typical for pig related MRSA. Illumina sequencing and spa typing were not working perfectly since the used program was not able to distinguish spa types t034 and t011 from each other. The problem was probably due to very similar short tandem repeats that these two spa types share. Also, Illumina sequencing is known to produce short reads that could be problematic for sequence assembly. All the strains were resistant to beta-lactams and tetracycline which is typical for MRSA CC398 strains. Many strains were also resistant to clindamycin and trimethoprim. Antimicrobial resistance seemed to be carried by plasmids in some cases because the strains carried several plasmids that are known to contain antimicrobial resistance genes. The antimicrobial resistance profiles were different between different spa types since some spa types were more resistant to certain antimicrobials than others. According to the phylogenetic tree, the strains seemed to be a very heterogenic group. The strains that belonged in the same spa type were most related to each other as expected. There were no differences between strains originating from pigs and strains originating from pork which strongly indicates that bacteria could have spread from pigs to pork. Asymptomatic pigs also carried similar strains as infected pigs. The strains that were causing infections in pigs did not contain any more virulence factors compared to the other strains. The study gave plenty of new information concerning MRSA CC398 in Finnish pigs and pork. The antimicrobial resistance and virulence patterns in addition to other qualities of the strains were very similar that was described in the literature before. The strains seemed not to be very virulent for humans, but the situation must be observed in case of increasing resistance and virulence. The best way to prevent spreading of MRSA is to decrease the amount of MRSA in pig farms since MRSA bacteria are most likely to spread from pigs to the environment and to the people who work in pig farms and from there to the rest of the population.
Discipline: biokemia
Biochemistry
biokemi


Files in this item

Files Size Format View

There are no files associated with this item.

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record