Generation of a genetically modified oncolytic platform for cancer immunotherapy

Visa fullständig post



Permalänk

http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-201811013487
Titel: Generation of a genetically modified oncolytic platform for cancer immunotherapy
Sekundär titel: Geneettisesti muunnellun onkolyyttisen viruksen kehittäminen syövän immunoterapiaan
Författare: Sjöberg, Madeleine
Medarbetare: Helsingin yliopisto, Farmasian tiedekunta, Farmasian tiedekunta
University of Helsinki, Faculty of Pharmacy, Faculty of Pharmacy
Helsingfors universitet, Farmaceutiska fakulteten, Farmaceutiska fakulteten
Utgivare: Helsingfors universitet
Datum: 2018
Språk: eng
Permanenta länken (URI): http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-201811013487
http://hdl.handle.net/10138/277671
Nivå: pro gradu -avhandlingar
Utbildningsprogram: none
Studieinriktning: none
Ämne: Biofarmasia
Biopharmaceutics
Biofarmaci
Abstrakt: Maailmalla sairastuu vuosittain yhä enemmän ihmisiä syöpään. Uusien syöpähoitojen tarve on ollut jatkuva johtuen mm. syövän monimutkaisesta ja vielä osittain tuntemattomasta patofysiologiasta ja hoitoresistenssistä. Immunoterapia on lupaava kasvava ala onkologiassa, josta yksi osa-alue on onkolyyttiset virushoidot. Nämä virushoidot hyödyntävät joidenkin virusten luontaista tai muunneltua kykyä selektiiviselle monistumiselle syöpäsoluissa. Yksi näistä viruksista on adenovirus. Näillä viruksilla on mahdollista muunnella immuunivastetta, esim. saamalla ne ekspressoimaan tietyt geenit. Tämä työ keskittyy onkolyyttisen adenoviruksen geneettiseen aseistamiseen hoidon tehokkuuden parantamiseksi. Kostimulatorinen molekyyli CD40 ligandi (CD40L) valittiin transgeeniksi sen immuunijärjestelmää stimuloivan kyvyn vuoksi. CD40L ekspressoivia adenoviruksia on suunniteltu aikaisemminkin, mutta uutuusarvoa toi liukenevan CD40L suunnittelu ja sisällytys projektiin. Tutkimuksen päätavoite oli neljän toiminallisen onkolyyttisen adenoviruksen tuotanto, jossa kukin kantaa joko ihmis- tai hiirivarianttia kokopitkästä tai liukenevasta CD40L:sta. Tavoitteen onnistunut toteutus vaati protokollien perustamisen kloonaukseen, bakteeripesäkkeiden seulontaan ja primaarivirustuotantoon. CD40L transgeenien sijoittaminen valittuun Ad5Δ24 plasmidin E3-gp19k alueeseen yritettiin ensin perinteisellä homologisella rekombinaatiolla. Kloonaus onnistui lopulta soveltamalla yksivaiheinen Gibson Assembly® reaktio. Bakteeripesäkkeet seulottiin ensin polymeraasiketjureaktiolla, jonka jälkeen mahdolliset CD40L positiiviset kloonit jatkoivat restriktioanalyysin vahvistaakseen transgeenin integraatio viruksen perimään. Myös kriittisten elementtien säilyminen varmistettiin. Kaksi kolmesta kokopitkää ihmisperäistä CD40L kantavaa rekombinoitua plasmidia transfektoitiin A549 soluihin tuottamaan primaarivirusta, jonka jälkeen adenoviruksen läsnäolo ja CD40L ekspressio vahvistettiin immunovärjäyksellä. Lopulta protokollaa perustettiin onnistuneesti konstruoimalla yksi neljästä suunnitelluista viruksista. Protokolla kattaa kaikki geneettisen aseistamisen päävaiheet kloonauksesta primaarivirustuotantoon, tarjoten myös mahdollisuuden sovittaa sitä Ad5Δ24 aseistamiseen muilla kiinnostavilla transgeeneillä. Projektin seuraavassa vaiheessa, jäljellä olevien kolmen viruksien tuotannon jälkeen, validoidaan transgeenien ekspressio ja toiminnallisuutta kaikilla konstruktioilla. Tämän jälkeen verrataan liukenevan ja kokopitkän CD40L immuunijärjestelmää stimuloivaa kykyä ja tuloksien olleen lupaavia, siirrytään toivottavasti in vivo-kokeisiin.Cancer afflicts an ever-growing number of people globally each year. In part due to a complex pathophysiology where much is still unknown, the need for new cancer treatments has been persistent, fuelled further by the issue of treatment resistance. An emerging field holding much promise in oncology is immunotherapy, a subgroup of which is oncolytic virus treatments. These treatments utilize the inherent or acquired ability of certain viruses to selectively replicate in tumor cells to fight cancer. One of these viruses is the adenovirus. With these viruses it is possible to modulate the immune response e.g. through the expression of certain genes. The thesis focuses on genetically arming an oncolytic adenovirus in an effort to enhance treatment efficacy. The transgene of choice is the CD40 ligand (CD40L), a costimulatory molecule capable of aiding in the development of systemic antitumor immunity. Adenoviruses have previously been designed expressing the CD40L, however, a novel aspect was introduced with the design and incorporation of a soluble a form of the protein. The main aim of the study was the construction of four functional oncolytic adenoviruses, encoded with either the human or mouse variants of the two CD40L proteins (full-length and soluble). Successful completion required protocols for the cloning, bacterial colony screening, and primary virus production to be established. Insertion of the CD40L transgenes into the E3-gp19k region of the chosen Ad5Δ24 backbone was first attempted with the traditional approach of homologous recombination. The method that ultimately proved successful was a one-step Gibson Assembly® reaction. Screening the bacterial colonies with colony polymerase chain reaction, the potential CD40L positive clones underwent restriction analysis to affirm the presence of the transgene in the viral genome, as well as the retainment of critical elements. Two out of three recombined plasmids carrying the full-length CD40L proceeded to transfection and virus propagation in A549 cells, after which the presence of the adenovirus and CD40L expression was confirmed with immunostaining. Finally, a protocol was successfully established by the construction of one of the intended four viruses. The protocol entails all the main steps from cloning until primary virus production, additionally offering the option of applying it to the genetic arming of the Ad5Δ24 with other transgenes of interest. In terms of future perspectives for the project, following construction of the remaining viruses, the intentions are to validate transgene expression and functionality for all constructs, as well as compare the immunogenicity between the full-length and soluble CD40L. In the event of promising results, the project will hopefully proceed to in vivo studies.
Subject: oncolytic adenovirus
CD40 ligand
genetic arming
homologous recombination
Gibson Assembly®
onkolyyttinen adenovirus
CD40 ligandi
geneettinen aseistaminen
homologinen rekombinaatio
Gibson Assembly®


Filer under denna titel

Filer Storlek Format Granska

There are no files associated with this item.

Detta dokument registreras i samling:

Visa fullständig post