Yliopiston etusivulle Suomeksi På svenska In English Helsingin yliopisto

Production and Purification of Recombinant Human Vascular Endothelial Growth Factor D

Show simple item record

dc.contributor Helsingin yliopisto, Bio- ja Ympäristötieteellinen tiedekunta, Biotieteiden laitos fi
dc.contributor.author Aho, Kukka
dc.date.accessioned 2012-02-03T07:52:17Z
dc.date.available 2012-02-03T07:52:17Z
dc.date.issued 2012-02-03
dc.identifier.uri http://hdl.handle.net/10138/29574
dc.description.abstract In multicellular organisms, complex signalling mechanisms have evolved to guide the behaviour of individual cells. Growth factors are secreted proteins that can stimulate the proliferation and/or differentiation of cells. Vascular endothelial growth factor D (VEGF-D) is a ligand for VEGF receptor 2 (VEGFR-2) and for VEGFR-3, which are predominantly expressed on blood vascular endothelial cells and on lymphatic endothelial cells, respectively. Thus VEGF-D can contribute to growth of both blood vessels (angiogenesis) and lymphatic vessels (lymphangiogenesis). Although there have been many reports showing the angiogenic and lymphangiogenic effects of VEGF-D, its physiological role is still largely unknown. Most of these reports are severely hampered by incomplete characterization of the specific form of VEGF-D that was used. During or after secretion, VEGF-D undergoes complicated proteolytic processing. Alternative Nterminal cleavage results in two different fully processed forms, VEGF-D major and VEGF-D minor. Processing significantly increases the activity of VEGF-D towards its receptors. Surprisingly, it is still unknown whether the differential N-terminal cleavage of VEGF-D has any effect on receptor binding activity or on receptor activation. The goal of this study was to produce and purify high quality biologically active VEGF-D which is needed for studying the physiological role of this growth factor. Several different forms of recombinant human VEGF-D were produced using the Drosophila Schneider 2 insect cell system. A bioassay utilizing the Ba/F3 cells expressing chimeric VEGFR/EpoR receptors was used to determine the receptor binding activities of recombinant VEGF-Ds. Two constructs producing biologically active VEGF-Ds were chosen for chromatographic purification (untagged major and his-tagged major forms). During purification, the activity of both VEGF-D forms towards their receptors decreased significantly. In case of the untagged form, this was presumably due to some residual proteolytic activity during purifications. The results might indicate that only the major form is responsible for the activation of VEGFR-3. The fact that no activity of the minor forms was detected when screening the cell supernatants with Ba/F3-VEGFR-3-EpoR-bioassay, supports this explanation. If this explanation can be verified, the role of the alternative N-terminal cleavage becomes obvious: By proteolysis the activity of VEGF-D can be redirected from the lymphatics towards the blood vessels. fi
dc.description.abstract Yksittäisten solujen toimintaa monisoluisissa eläimissä ohjaavat mutkikkaat viestintäverkostot. Solujen jakautumista ja erilaistumista kiihdyttävät mm. kasvutekijät, jotka ovat soluista eritettäviä proteiineja. VEGF-D on kasvutekijä, joka sitoutuu reseptoreihinsa VEGFR-2 ja VEGFR-3. VEGFR-2:sta ilmennetään pääasiassa verisuonten ja VEGFR-3:sta imusuonten seinämän solujen pinnalla. VEGF-D kykenee täten edistämään sekä veri- että imusuonten kasvua. Vaikka monissa julkaisuissa on kerrottu VEGF-D:n kiihdyttävän veri- ja imusuonten kasvua, sen biologinen merkitys on silti huonosti tunnettu. Usein julkaisuissa käytetyn VEGF-D:n muotoa ei ole tarkkaan määritelty. VEGF-D:tä muokataan proteolyyttisesti molemmista päistä erityksen yhteydessä. Aminoterminaalisen pään vaihtoehtoinen pilkkominen tuottaa kaksi erilaista muotoa VEGF-D:stä; isomman VEGF-D:n ja pienemmän VEGF-D:n. Proteolyyttinen muokkaus lisää huomattavasti VEGF-D:n sitoutumisaktiivisuutta reseptoreihinsa. Vielä ei kuitenkaan tiedetä vaikuttaako vaihtoehtoinen aminoterminaalinen pilkkominen VEGF-D:n kykyyn sitoutua tai aktivoida reseptoreitaan. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tuottaa korkealaatuista ja aktiivisuudeltaan luontaisen VEGF-D:n kaltaista proteiinia, jota tarvitaan VEGF-D:n biologisen roolin selvittämiseksi. Useita eri muotoja ihmisen rekombinattia VEGF-D:tä tuotettiin banaanikärpäsen Schneider 2-soluissa. Tuotettujen proteiinien reseptoriaffiniteettiä tutkittiin käyttäen Ba/F3 soluja, jotka ilmentävät kimeerisiä VEGFR-EpoR reseptoreita. Kaksi biologisesti aktiivista VEGF-D:n muotoa valittiin kromatografisiin puhdistuksiin (molemmat isompia muotoja joissa toisessa histidiiniliite). Puhdistuksen aikana molempien VEGF-D:n muotojen aktiivisuus laski merkittävästi. Tulokset viittaavat siihen että vain isompi VEGF-D kykenee aktivoimaan VEGFR-3:n. Tätä huomiota tukee myös se, että tuotettujen proteiininen reseptoriaffiniteettiä tutkittaessa, yksikään pienemmistä muodoista ei osoittanut aktiivisuutta Ba/F3-VEGFR-3-EpoR-testissä. Jos tämä selitys pitää paikkansa, aminoterminaalisen pään pilkkomisen merkitys selviää: VEGF-D:n toimintaa voidaan vaihtoehtoisesti pilkkomalla suunnata aktivoimaan joko veri-tai imusuonia. fi
dc.language.iso en fi
dc.subject opinnäytteet fi
dc.subject pro gradu-tutkielmat fi
dc.subject VEGF-D
dc.subject recombinant protein production
dc.subject biological activity
dc.subject rekombinattiproteiinin tuotto
dc.subject biologinen aktiivisuus
dc.title Production and Purification of Recombinant Human Vascular Endothelial Growth Factor D fi
dc.title.alternative Ihmisen VEGF-D-kasvutekijän tuotto ja puhdistus (Production and Purification of Recombinant Human Vascular Endothelial Growth Factor D) fi
dc.type.ontasot Pro gradu -työ fi
dc.subject.discipline Perinnöllisyystiede fi

Files in this item

Files Description Size Format View/Open
Kukan valmis Gradu.pdf 2.613Mb PDF View/Open
This item appears in the following Collection(s)

Show simple item record

Search Helda


Advanced Search

Browse

My Account