The Interplay Between MAPK/ERK & cAMP/PKA Pathways and the Expression Levels of MUC2 & AGR2 in Human Colorectal Adenocarcinoma Cell Lines LS174T, LoVo & HT29

Show full item record

Permalink

http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-201901091016
Title: The Interplay Between MAPK/ERK & cAMP/PKA Pathways and the Expression Levels of MUC2 & AGR2 in Human Colorectal Adenocarcinoma Cell Lines LS174T, LoVo & HT29
Author: Tarkiainen, Susanna
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Biological and Environmental Sciences, Faculty of Biological and Environmental Sciences
Publisher: Helsingin yliopisto
Date: 2018
URI: http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-201901091016
http://hdl.handle.net/10138/298330
Thesis level: master's thesis
Abstract: Tämän tutkimuksen motivaatio tulee pyrkimyksestä löytää uusia hoitokeinoja harvinaisen pseudomyksooma peritonei (PMP) syövän hoitoon. PMP on musinoottinen, umpilisäkkeestä lähtöisin oleva hitaasti etenevä adenokarsinooma, jonka solut leviävät vatsaonteloon. Nämä syöpäsolut tuottavat suuria määriä limaa, jonka pääkomponentti on massiivinen MUC2 glykoproteiini. AGR2 on proteiini disulfidi isomeraasi, joka avustaa MUC2:n intramolekulaaristen rikkisiltojen muodostumisessa ennen proteiinin eritystä, ja on välttämätön MUC2:n tuotossa. Liman erittyminen ja kertyminen vatsaontelon sisään PMP:ssä aiheuttaa painetta sisäelimille, ja johtaa lopulta kuolemaan. MUC2:n tuoton estäminen saattaisi siis hidastaa taudin etenemistä merkittävästi. MAPK/ERK ja cAMP/PKA signalointireitit stimuloivat MUC2:n tuottoa, ja aktivoivat mutaatiot niiden KRAS ja GNAS geeneissä ovat yleisiä PMP:ssä. Tämän tutkimuksen tavoite oli selvittää miten MUC2 ja AGR2 vaikuttavat toistensa ilmentymistasoihin, sekä mikä vaikutus MAPK/ERK ja cAMP/PKA signalointireitteihin vaikuttavilla aineilla kofeiinilla, teofyllinillä, cromolynillä, fudosteinella, oktreotidilla ja lanreotidilla, on MUC2:n ilmentymiseen in vitro. Tutkimuksessa käytettiin kolorektaalisen adenokarsinooman solulinjoja LS174T, LoVo ja HT29, jotka erittävät suuria määriä MUC2:ta. Lisäksi LS174T ja LoVo soluilla on aktivoiva heterotsygoottinen KRAS mutaatio. MUC2:n ja AGR2:n ilmentymistä mitattiin mRNA tasolla kvantitatiivisella tosiaika-polymeraasiketjureaktiolla. MUC2:n vaikutusta AGR2:n tuottoon, sekä vastaavasti AGR2:n vaikutusta MUC2:n tuottoon tutkittiin hiljentämällä vuorollaan molempia vastaavalla siRNA:lla. MUC2 siRNA:lla sekä MUC2 että AGR2 mRNA tasot laskivat 50 prosenttiin LS174T soluissa ja 40 prosenttiin LoVo soluissa kontrolliryhmiinsä nähden. AGR2 siRNA:lla AGR2 mRNA tasot laskivat niin ikään 50 prosenttiin LS174T soluissa ja jopa 30 prosenttiin LoVo soluissa kontrolliryhmiinsä nähden, mutta MUC2 mRNA tasot eivät näissä muuttuneet tilastollisesti merkittävästi. Kofeiini ja teofylliini estävät cAMP/PKA signalointireitin fosfodiesteraasia, joka hydrolysoi toisiolähetti cAMP:tä AMP:ksi, ja näin ollen pitävät cAMP/PKA signalointireittiä aktiivisena pidempään. Sekä LS174T että LoVo soluissa kofeiini stimuloi MUC2:n tuottoa. LoVo soluissa, joissa MUC2:n tuotto kasvoi huomattavasti enemmän, myös AGR2:n ilmentymistasot nousivat. Teestä löytyvällä teofyllinillä, jota myös käytetään lääkkeenä astman hoidossa, ei ollut vaikutusta MUC2:n tuottoon. PMP syöpäsolut ilmentävät S100P proteiinia. Cromolyn on astmalääke, ja sen tiedetään sitoutuvan S100P proteiiniin ja siten estävän S100P:n ja RAGE:n interaktiot, joka puolestaan estää RAGE:a aktivoimasta MAPK/ERK signalointireittiä. Fudosteine puolestaan on mukoaktiivinen lääke, joka vähentää keuhkojen liman pääkomponentin MUC5AC:n tuottoa. Aktivoiva GNAS mutaatio lisää niin MUC2:n kuin MUC5AC:n tuottoa HT29 soluissa, joten molempien ilmentymistä säädellään ainakin osittain samoilla tavoilla. Lisäksi somatostatiinianalogit oktreotidi ja lanreotidi estävät MAPK/ERK signalointireitin ERK1/2 kinaasia, sekä cAMP/PKA signalointireitin proteiini kinaasi A:ta, joka ei tällöin pysty tuottamaan cAMP:tä. Mikään näistä neljästä lääkeaineesta ei kuitenkaan pystynyt estämään MUC2:n tuottoa missään tässä tutkimuksessa testatuissa solulinjoissa in vitro.The motivation of this study was to find new treatment options for the rare cancer pseudomyxoma peritonei (PMP). PMP is a slowly progressing mucinous adenocarcinoma that originates from the appendix and disseminates into the peritoneum where the cancer cells secrete large amounts of MUC2, the main component of intestinal mucus, into the peritoneum. The disulfide isomerase AGR2 helps MUC2 with forming the correct intramolecular disulfide bonds prior secretion, and is essential to MUC2 protein production. The mucus build-up into the peritoneum causes stress on vital organs, and eventually death. Therefore, inhibiting MUC2 production in PMP cancer cells might slow down the disease progression significantly. MAPK/ERK and cAMP/PKA signaling pathways stimulate MUC2 production, and activating mutations in KRAS and GNAS of these pathways are common in PMP. The aim of this study was to elucidate how MUC2 and AGR2 affect each other’s expression levels, and how the MAPK/ERK pathway and the cAMP/PKA pathway targeting substances caffeine, theophylline, cromolyn, fudosteine, octreotide, and lanreotide, affect MUC2 expression in vitro. This study was conducted on human colorectal adenocarcinoma cell lines LS174T, LoVo, and HT29 that all produce large amounts of MUC2. In addition, LS174T and LoVo cell lines carry activating heterozygous mutations in their KRAS genes. MUC2 and AGR2 expression levels were measured on mRNA level with real-time quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction. The effects of MUC2 on AGR2 expression, and vice versa, were tested by silencing each at a time with the appropriate siRNA. MUC2 siRNA suppressed both MUC2 and AGR2 mRNA levels down to 50 % in LS174T cells and down to 40 % in LoVo cells in respect to their control groups. AGR2 siRNA suppressed AGR2 mRNA levels down to 50 % in LS174T cells and even down to 30 % in LoVo cells in respect to their control groups, while there were no statistically significant changes in MUC2 mRNA levels. Caffeine and theophylline inhibit phosphodiesterase of the cAMP/PKA signaling pathway, and in consequence, the hydrolysis of the secondary messenger cAMP, prolonging the activation of the pathway. Caffeine stimulated MUC2 production in LS174T and LoVo cells. In addition, AGR2 mRNA levels increased in LoVo cells, in which the fold change in MUC2 mRNA levels was much greater. Theophylline, a compound found in tea, and used for the treatment of asthma, did not affect MUC2 production. PMP cancer cells express protein S100P. Cromolyn is a pharmaceutical substance used for the treatment of asthma, and it inhibits S100P, and thereby S100P/RAGE signaling -dependent activation of MAPK/ERK pathway. Fudosteine, on the other hand, is a mucoactive pharmaceutical substance that lowers the production of MUC5AC, the main component of lung mucus. Since activating GNAS mutation stimulates the production of both MUC2 and MUC5AC in HT29 cells, the expression of both must be at least partially controlled by same mechanisms. In addition, Somatostatin analogues octreotide and lanreotide inhibit ERK1/2 of the MAPK/ERK pathway, as well as protein kinase A of the cAMP/PKA pathway, and hence cAMP production. However, none of these four tested pharmaceutical substances were able to inhibit MUC2 production in the cell lines used this study in vitro.
Discipline: biokemia
Biochemistry
biokemi


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
Tarkiainen, Susanna, Pro Gradu, 2018.pdf 6.498Mb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record