Analysis of nuclear actin-interacting proteins and actin-regulated transcription factors

Näytä tavanomaiset kuvailutiedot

dc.contributor Helsingin yliopisto, bio- ja ympäristötieteellinen tiedekunta fi
dc.contributor Helsingfors universitet, bio- och miljövetenskapliga fakulteten sv
dc.contributor University of Helsinki, Faculty of Biological and Environmental Sciences, Perinnöllisyystieteet en
dc.contributor Integroivien biotieteiden tohtoriohjelma fi
dc.contributor Doktorandprogrammet i integrerande biovetenskap sv
dc.contributor Doctoral Programme in Integrative Life Science en
dc.contributor.author Viita, Tiina
dc.date.accessioned 2019-02-27T06:00:39Z
dc.date.available 2019-03-05
dc.date.available 2019-02-27T06:00:39Z
dc.date.issued 2019-03-15
dc.identifier.uri URN:ISBN:978-951-51-4950-3
dc.identifier.uri http://hdl.handle.net/10138/299539
dc.description.abstract Actin is best-known from its functions in the cytoplasm, where it is a key component of the cytoskeleton. Nevertheless, functions of actin are not restricted to the cytoplasm, since actin is also present in the nucleus, where it has been linked to multiple functions from gene activation to chromatin remodeling. However, molecular mechanisms by which actin operates in the nucleus are still poorly understood. This is mainly because of the lack of well-characterized binding partners for nuclear actin. Therefore, the aim of this thesis was to identify and characterize novel nuclear actin-binding partners and elucidate the molecular mechanisms behind actin regulated transcription factors. To identify nuclear actin-binding partners, we used two complementary mass spectrometry (MS) techniques, affinity purification combined with MS (AP-MS) and proximity dependent biotin identification with MS (BioID). Analysis of our interactome data revealed that actin can form stable complexes with proteins related to chromatin remodeling but seems to function in a dynamic fashion in other nuclear processes, such as transcription and DNA replication. In our experimental setup actin seemed to be monomeric when it associated with nuclear complexes. We also discovered a novel actin-containing complex, human Ada-Two-A-containing complex (hATAC). HATAC is a histone modifying complex and actin directly binds one of it subunits, lysine acetyltransferase 14 (KAT14). We showed that actin-binding modulates histone acetyl transferase (HAT) activity of KAT14 in vitro and in cells. Our interactome data also indicated that actin could be involved in RNA splicing and mRNA processing. Further experiments showed, for the first time, that actin has a functional role in mRNA splicing, as alterations in nuclear actin levels disturbed survival motor neuron protein 2 (SMN2) alternative exon skipping. In addition, the nuclear actin interactome analysis provided new insights into nuclear processes already earlier linked to actin, such as chromatin remodeling, transcription and DNA replication, and hence this work provides a protein interaction platform for further mechanistic studies of nuclear actin-dependent functions. One well-known protein, which is known to bind nuclear actin and to regulate transcription is myocardin-related transcription factor A (MRTF-A), a co-activator of serum response factor (SRF). MRTF-A has a RPEL domain, which can regulate the localization and activity of MRTF-A in response to actin dynamics. Interestingly, also phosphatase and actin regulator (Phactr) protein family contains RPEL domain and binds protein phosphatase 1 (PP1). The molecular properties of MRTF-A intrigued us to study if the Phactr-proteins could be putative binding partners of nuclear actin. We revealed that the RPEL domain of Phactr4 do not regulate the subcellular localization of Phactr4. Instead, Phactr4 controls the activity of PP1 in response to actin monomer levels in the cytoplasm, thereby creating a feedback loop that maintains actin homeostasis in cells. In addition, we were able to show that MRTF-A subcellular localization is not solely dependent on actin, since DDX19, an ATP-dependent RNA helicase, can regulate nuclear import of full-length MRTF-A independently of actin dynamics. This thesis work has thereby broadened the knowledge of nuclear actin-binding partners as well as revealed novel regulatory properties of actin-regulated RPEL domain containing proteins. en
dc.description.abstract Tuma säätelee solun toimintaa ilmentämällä eri geenejä eri aikaan. Aktiinilla on tumassa tärkeä tehtävä geenien ilmentymisen säätelijänä. Aktiini tunnetaan paremmin tuman ulkopuolella, jossa se toimii osana solun tukirankaa ja vaikuttaa solun liikkumiseen. Aktiinin on todettu vaikuttavan geenien ilmentymiseen sekä suoraan (sitoutumalla RNA-polymeraasiin) että välillisesti (sitoutumalla erilaisiin transkriptiota sääteleviin proteiineihin). Vaikka aktiinin merkitys soluntukirangassa tunnetaan varsin hyvin, ja tutkimuksissa on löydetty kymmeniä aktiinin kanssa vuorovaikuttavia proteiineja, tuman aktiinin kanssa suorasti vuorovaikuttavia proteiineja tiedetään varsin vähän. Myös suorat todisteet tuman aktiinin molekulaarisista mekanismeista monien tuman tehtävien osalta puuttuvat. Tässä tutkimuksessa on kartoitettu uusia tuman aktiinin kanssa vuorovaikuttavia proteiineja massaspektrometriaan perustuvilla menetelmillä (AP-MS ja BioID). Tutkimuksemme osoittivat, että aktiini sitoutuu tuman komplekseihin monomeerina ja lisäksi se sitoutuu stabiilimmin kromatiininmuokkauskomplekseihin, mutta vain hetkellisesti transkriptioon ja DNA:n kahdentumiseen liittyviin proteiinikomplekseihin. Löysimme myös hATAC-proteiinikompleksin, jonka nyt osoitamme ensimmäistä kertaa sitoutuvan aktiiniin. HATAC tehtävänä on asetyloida histoneita ja tuloksemme osoittivat, että aktiini sitoutuu hATAC-kompleksin KAT14 alayksikköön ja säätelee KAT14:n histoniasetyylitransferaasi (HAT) aktiivisuutta in vitro ja in vivo. BioID:n avulla havaitsimme aktiinin vuorovaikuttavan dynaamisesti monien RNA:n silmukointiin liittyvien proteiinien kanssa. Tutkimuksemme osoittivat, että muutokset tuman aktiinin määrissä vaikuttavat SMN2 minigeenin vaihtoehtoiseen RNA:n silmukointiin. Täten osoitamme, ensimmäistä kertaa, että tuman aktiini on mukana RNA:n silmukoinnin säätelyssä. Uusien vuorovaikuttavien proteiininen löytäminen mahdollistaa perusteellisen molekulaaristen mekanismien tutkimisen tehtävissä, joihin tuman aktiini on aiemmin liitetty. Lisäksi väitöskirjatyössä on tutkittu, miten aktiini säätelee proteiineja, joilla on aktiini-monomeereja sitova RPEL domeeni. Parhaiten tunnettu, RPEL-domeenin sisältävä proteiini, on MRTF-A, joka on seerumi responsiivisen faktorin (SRF:n) koaktivaattori. Vasteena aktiinin polymerisaatiolle MRTF-A kulkeutuu solulimasta tumaan, jossa se yhdessä SRF:n kanssa aktivoi kohdegeenien transkriptiota. Toinen proteiiniperhe, joilla on RPEL-domeeni, on phosphatase and actin regulator (Phactr) proteiiniperhe. Näiden proteiinien on myös todettu sitoutuvat Protein Phosphatase 1 (PP1) proteiiniin. Tutkiessamme Phactr4 proteiinin RPEL-domeenin merkitystä ja havaitsimme, että Phactr4 aktivoi PP1 proteiinia aktiinivälitteisesti. Aktivoitunut PP1 proteiini säätelee paikallisesti aktiini-säkeiden ja aktiini-monomeerien tasapainoa soluissa, aktivoimalla säikeistä aktiinia pilkkovan kofiliinin. Täten todistimme, että aktiini itse pystyy säätelemään solun aktiini-säkeiden ja aktiini-monomeerien tasoja Phactr4:n RPEL-domeenin kautta. Lisäksi osoitimme, että aktiini ei yksinään säätele MRTF-A:n tumakuljetusta, sillä RNA helikaasi, DDX19, pystyy säätelemään MRTF-A:n tumakuljetusta aktiinin polymerisaatiosta riippumatta. Yhteenvetona voidaan todeta, että tutkimukseni on selkiyttänyt aktiini roolia tumassa kartoittamalla uusia, aktiinin kanssa vuorovaikuttavia proteiineja tuman sisällä. Tämän lisäksi olen työssäni löytänyt uusia säätelymekanismeja proteiineille, jotka sisältävät aktiini-monomeereja sitovan RPEL-domeenin. fi
dc.format.mimetype application/pdf
dc.language.iso en
dc.publisher Helsingin yliopisto fi
dc.publisher Helsingfors universitet sv
dc.publisher University of Helsinki en
dc.relation.isformatof URN:ISBN:978-951-51-4949-7
dc.relation.isformatof Hansaprint Oy: 2019, Dissertationes Scholae Doctoralis Ad Sanitatem Investigandam Universitatis Helsinkiensis. 2342-3161
dc.relation.ispartof Dissertationes Scholae Doctoralis Ad Sanitatem Investigandam Universitatis Helsinkiensis
dc.relation.ispartof URN:ISSN:2342-317X
dc.rights Julkaisu on tekijänoikeussäännösten alainen. Teosta voi lukea ja tulostaa henkilökohtaista käyttöä varten. Käyttö kaupallisiin tarkoituksiin on kielletty. fi
dc.rights This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited. en
dc.rights Publikationen är skyddad av upphovsrätten. Den får läsas och skrivas ut för personligt bruk. Användning i kommersiellt syfte är förbjuden. sv
dc.subject Molekulaariset ja integratiiviset biotieteet
dc.title Analysis of nuclear actin-interacting proteins and actin-regulated transcription factors en
dc.type.ontasot Väitöskirja (artikkeli) fi
dc.type.ontasot Doctoral dissertation (article-based) en
dc.type.ontasot Doktorsavhandling (sammanläggning) sv
dc.ths Vartiainen, Maria
dc.opn Fisher, Daniel
dc.type.dcmitype Text

Tiedostot

Latausmäärä yhteensä: Ladataan...

Tiedosto(t) Koko Formaatti Näytä
analysis.pdf 2.880MB PDF Avaa tiedosto

Viite kuuluu kokoelmiin:

Näytä tavanomaiset kuvailutiedot