Reticulon Homology Domain Containing Protein Families of the Endoplasmic Reticulum

Show full item record

Permalink

http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-51-5267-1
Title: Reticulon Homology Domain Containing Protein Families of the Endoplasmic Reticulum
Author: Kumar, Darshan
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Biological and Environmental Sciences
Doctoral Programme in Integrative Life Science
Thesis level: Doctoral dissertation (article-based)
Belongs to series: Reticulon Homology Domain Containing Protein Families of the Endoplasmic Reticulum - URN:ISSN:2342-317X
Abstract: The endoplasmic reticulum (ER) is the largest membrane bound organelle in a cell and has multiple responsibilities. Execution of the various duties performed by the ER requires it to be shaped in a rather complex and intricate manner. ER’s two major structural motives, namely sheets and tubules, play very complex yet not fully understood role in giving ER its overall structure and function. The ratio of sheet and tubule conformations differ significantly within cell types and during cell cycle. Such a balance is possible only with a well-functioning set of factors that constantly communicate with each other throughout a cell cycle. These factors are specifically responsible for either shaping the ER sheets or tubules in addition to factors that keep the dynamic nature of the ER sound. During mitosis, ER undergoes a major transformation in its structure, where the sheet-tubule ratio shifts more towards tubules. Specific factors keep this process sound by acting actively during the stage of mitosis for proper cell division to occur. Although research on such factors are still on-going, many in-depth details on such factors (e.g. their precise localization) and their mechanism of action plus novel factors for ER shaping still needs to be resolved using techniques involving high end light and electron microscopy. In addition, a constant battle in data analysis for answering key questions also persists. Development of tools to study and analyse data on the lines of image analysis and processing is an unmet need that needs simultaneous attention. The research in this thesis focuses on three family of proteins that we uncover as responsible candidates in shaping the ER. To aid the study, this thesis also discusses the development of a software platform for analysis of microscopic data generated during this study. In this research, Reticulon family of proteins (RTN) were characterised using high-end microscopic techniques. We showed RTN4A and RTN4B to localize to ER tubules and sheet edges using pre-embedding immuno electron microscopy (immuno-EM) and electron tomography. Using qPCR, RTN4A and RTN4B were observed to be the most expressed isoforms in neurons and epithelial cells respectively. FAM134C, a poorly characterised protein was identified as one of the RTN4B interacting proteins. FAM134C localised to the ER where it specifically resided at high curvature ER (sheet edges and tubules) similar to RTN4B. FAM134C, similar to the RTN4B also had the capability to promote ER tubules upon overexpression. In addition, another family of proteins belonging to receptor expression enhancing protein (REEP), namely REEP3 and REEP4 were studied for shaping ER during mitotic stage of cell cycle. REEP3 and REEP4 collectively were observed both in tubulating peripheral ER during mitosis and clearing tubular ER from the chromatin for a normal mitosis to take place. Collectively, this work elaborates on proteins belonging to three classes that shape and position the ER specifically either in interphase or during stages of cell division. Our findings also throws light on the role of different domains in each of these proteins such as the reticulon homology domain (RHD) that was observed to be present in all these proteins under study. The RHD previously known for inserting partially and unsymmetrically in the outer leaflet of the ER gives a strong indication for proteins like RTN4B and FAM134C to localize to ER thus tubulating ER upon overexpression conditions. We uncovered the RHD’s crucial role in ER shaping and positioning in REEP3/4 during mitosis.Endoplasma- eli solulimakalvosto (engl. endoplasmic reticulum, ER) on solun suurin kalvon rajoittama organelli, ja sillä on useita tehtäviä. Pystyäkseen suoriutumaan eri tehtävistään ER:n rakenne on monimuotoinen ja alati muuntautuva. ER:n päärakenteet, laatat ja tubulukset, muodostavat monimutkaisen verkoston, eikä niiden kaikkia toimintoja täysin vielä tunneta. Laattojen ja tubulusten määrällinen suhde on erilainen eri solutyypeissä ja solusyklin vaiheissa. ER:n toimivan tasapainon saavuttamiseksi tarvitaan useita tekijöitä, jotka ovat vuorovaikutuksessa keskenään koko solusyklin ajan. Osa näistä tekijöistä osallistuu ER:n rakenteen muokkaamiseen ja osa on vastuussa ER:n dynaamisesta luonteesta. Solunjakautumisen aikana ER:n rakenne muuttuu, ja tubulaarisia rakenteita muodostuu suhteellisesti enemmän. Eri tekijät toimivat aktiivisesti solunjakautumisen eri vaiheissa mahdollistaen näin solujen jakautumisen. Nämä tekijät ovat edelleen tutkimuksen kohteena, ja yksityiskohtien esim. tarkan paikantumisen ja toimintamekanismin selvittämiseksi sekä vielä tuntemattomien, ER:n rakenteeseen vaikuttavien tekijöiden löytämiseksi, on käytettävä kehittyneitä tekniikoita kuten valo- ja elektronimikroskopiaa. Myös tietoaineiston analysoinnin täytyy edelleen kehittyä pystyäksemme vastaamaan tärkeisiin kysymyksiin, ja sen vuoksi sekä kuvankäsittelyyn että kuvien analysointiin tarvittavien ohjelmien kehittämiseen on kiinnitettävä erityistä huomiota. Tässä väitöskirjatutkimuksessa tutkittiin kolmea proteiiniperhettä, joiden osoitettiin vaikuttavan ER:n rakenteeseen. Tutkimuksen aikana otettujen mikroskooppikuvien analysointi oli tämän tutkimuksen kannalta oleellista ja tästä johtuen työssä käsitellään myös kuvankäsittelyohjelmiston kehittämistä. Tässä väitöskirjatutkimuksessa karakterisoitiin Reticulon-proteiineja (RTN) uusilla, kehittyneillä mikroskooppisilla tekniikoilla. Immuunielektronimikroskopialla ja elektronitomografialla osoitettiin RTN4A:n ja RTN4B:n paikallistuvan ER:n tubuluksiin ja laattojen reunoille. Kvantitatiivisella polymeraasiketjureaktiolla pystyttiin osoittamaan, että RTN4A on eniten ilmennetty muunnos hermosoluissa ja RTN4B vastaavasti pintakudossoluissa. Vähän tutkittu proteiini, FAM134C, tunnistettiin yhdeksi RTN4B:n kanssa vuorovaikutuksessa olevista proteiineista ja se paikallistettiin samankaltaisiin ER:n rakenteisiin kuin RTN4B (laattojen reunat ja tubulukset). FAM134C:n ja RTN4B:n ylituotto aikaansai tubulaaristen rakenteiden muodostamista. Lisäksi, ER:n rakenneproteiiniryhmän REEP (engl. receptor expression enhancing protein) proteiinien REEP3 ja REEP4 vaikutusta ER:n rakenteeseen tutkittiin solunjakautumisvaiheen aikana. Solunjakautumisvaiheessa REEP3 ja REEP4 paikallistettiin tubulaariseen, perifeeraaliseen ER:ään. Nämä proteiinit tarvittiin myös tubulaarisen ER:n irrottamiseksi kromatiinista normaalin solunjakautumisen aikaansaamiseksi. Tämä tutkimus syventää tietoja kolmen ER:ä muokkaavan proteiiniperheen proteiineista ja niiden paikallistumisesta ja vaikutuksista ER:n rakenteeseen niin kasvuvaiheessa kuin solunjakautumisen eri vaiheissa. Tulokset antavat myös lisätietoa eri domeenien rooleista näissä proteiineissa, esim. retikulonihomologia-domeenista (RHD), jonka löydettiin kaikista näistä proteiineista. RHD:n tiedetään olevan osittain kaksoiskalvorakenteen sisällä ja siten aiheuttavan kalvojen kaarevoitumista: tämä havaittiin myös ER:n tubuloitumisena ylituotettaessa RTN4B:tä tai FAM134C:tä. Tutkimuksen mukaan RHD:lla oli ratkaiseva rooli ER:n REEP 3/4 rakenneproteiinien toiminnassa solunjakautumisen aikana.
URI: URN:ISBN:978-951-51-5267-1
http://hdl.handle.net/10138/302292
Date: 2019-06-14
Subject: Molecular and Cell Biology
Rights: This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
reticulo.pdf 56.60Mb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record