Evaluation of the Sequencing Pipeline for the Oxford Nanopore MinION Long-read DNA Sequencer

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-201906122648
Title: Evaluation of the Sequencing Pipeline for the Oxford Nanopore MinION Long-read DNA Sequencer
Author: Koivunen, Sampo
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Agriculture and Forestry, Department of Agricultural Sciences
Publisher: Helsingin yliopisto
Date: 2019
Language: eng
URI: http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-201906122648
http://hdl.handle.net/10138/303077
Thesis level: master's thesis
Discipline: Biotekniikka (MAAT)
Biotechnology (MAAT)
Bioteknik (MAAT)
Abstract: Oxford Nanopore MinION on uusi kolmannen sukupolven sekvensointilaite, jolla on monia erityispirteitä. MinION:n käyttämä nanopore -sekvensointimenetelmä perustuu havaittavissa olevien jännitevirtausten muutosten mittaamiseen DNA- tai RNA-juosteiden kulkeutuessa nanokokoisten huokosten eli porejen kautta membraanin läpi. Menetelmä mahdollistaa juosteiden suoran sekvensoimisen ilman välireaktioita. Uniikista sekvensointitavastaan johtuen MinION -laitteen tyyppiominaisuudet ovat hyvin erilaiset kuin laajemmin käytössä olevilla sekvensointilaitteilla. Myös MinION -laitteen poikkeuksellisen pieni koko auttaa sitä entisestään erottumaan kilpailijoistaan. Nanopore-pohjainen sekvensointiteknologia ja MinION ovat kuitenkin olleet kaupallisesti saatavilla vasta lyhyen aikaa. Siksi menetelmä on vielä suurelta osin standardisoimaton ja sen sovellettavuutta tutkimuskäytössä ei pystytä vielä tarkasti arvioimaan. Tässä pro gradu -työssä kuvataan MinION -sekvensoinnin käyttöönottoa sekä arvioidaan sen suorituskykyä. Työn käytännön tutkimus aloitettiin jo ennen laitteen kaupallista julkaisua markkinoille osana erillistä ennakkotestausohjelmaa nimeltä MinION Access Programme (MAP) ja se jatkui katkeamatta myös MinION:n kaupallisen lanseerauksen jälkeen. Tutkimuksessa sekvensoitiin sekä E.coli-kasvatuksesta että ihmisverestä eristettyjä gDNA-näytteitä. Tuloksena saadut sekvenssit oli pääosin mahdollista linjata referenssigenomeihin. Sekvensointi- ja analyysivaiheiden optimoinnin jälkeen yhdellä sirulla pystyttiin tuottamaan tarpeeksi sekvenssidataa kattamaan E.coli-genomi kokonaisuudessaan keskimääräisellä 180x lukusyvyydellä. Tutkimuksessa arvioitiin MinION:n suorituskykyä tavoitteena arvioida, sopiiko menetelmä ihmisgenomin hankalasti sekvensoitavien alueiden luotettavaan tutkimiseen. Lisäksi testattiin mahdollisuutta täydentää sekvensointimenetelmää erillisellä protokollalla kohdennetun sekvensoinnin toteuttamiseksi. Tutkimuksen tulokset osoittavat, että MinION – menetelmää voidaan käyttää pitkien ja linjattavissa olevien sekvenssien tuottamiseen. Sirujen sekvensointikapasiteetti ja sekvenssien laatu kuitenkin rajoittavat menetelmän käytettävyyttä monimutkaisempien genomien tutkimuksessa. Kohdennusprotokollan ja muiden täydentävien menetelmien liittäminen osaksi sekvensointiprosessia voi auttaa näiden puutteiden ratkaisemisessa, mutta tällaisten laajennusprotokollien käyttöönotto saattaa olla haasteellista.The Oxford Nanopore MinION is a third generation sequencer utilizing nanopore sequencing technology. The nanopore sequencing method allows sequencing of either DNA or RNA strands as they pass through the membrane-embedded nanopores. By measuring the corresponding fluctuations in the ion flow passing through the nanopore the passing strands can be sequenced directly without additional second-hand reactions or measurements. The MinION sequencing has very distinctly different characteristics compared to the market leaders of the sequencing field. The small form factor of the device further helps it to separate itself from the other alternatives. However, the technology has only been on the market for a very short time and thus very little golden standards regarding its capabilities or usage have been established. This thesis describes our experiences testing the capabilities of the MinION sequencer both before its commercial release as a part of a special early access program, as well as our continued experiments with the device following its commercial launch. The main results of this study include successfully sequencing and aligning E.coli and human gDNA samples to their respective reference genomes. Using our sequencing and analysis pipeline specifically tuned to the MinION we were able to sequence the entire E.coli genome on a single MinION flow cell with an average depth of around 180. Over the course of the thesis project the MinION sequencing protocol was evaluated and optimized in order to determine whether it has the potential to achieve our ultimate goal of reliably sequencing the previously inaccessible genomic regions of the human genome. The possibility of augmenting the sequencing protocol by adding the pre-sequencing target enrichment was also explored. Ultimately we were able to confirm that the MinION sequencer can be used to sequence long DNA fragments from a multitude of sample types. The majority of the produced reads could successfully be aligned against a reference genome. However, the limited yield and sequencing quality of a single experiment does limit the applicability of the method for more complicated genomic studies. These issues can be addressed with various techniques, chiefly target enrichment, but adapting such methods into the sequencing pipeline has its own challenges.
Subject: NGS
third-generation sequencing
long-read sequencing
sequencing
nanopore
MinION
bioinformatics
data analysis
Oxford Nanopore Technologies
NGS
kolmannen sukupolven sekvensointi
pitkäjuosteinen sekvensointi
sekvensointi
nanopore
MinION
bioinformatiikka
data-analyysi
Oxford Nanopore Technologies


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
Koivunen_Sampo_Pro_gradu_2019.pdf 1.684Mb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record