Surface layer protein SlpC expression in different growth modes of Lactobacillus brevis ATCC 14869

Abstract

Monilla bakteereilla on soluseinän ulkopuolella pintakerros, joka koostuu itsestään järjestäytyvistä, yleensä identtisistä proteiini- tai glykoproteiiniyksiköistä. Lactobacillus brevis ATCC 14869 -kannalta on löytynyt vapaasti kasvavissa eli planktonisissa soluissa kaksi pintakerrosproteiinia, SlpB ja SlpD. Myös kolmannen pintaproteiinin geeni slpC on löydetty, mutta itse proteiinia ei aikaisemman tutkimuksen planktonisissa olosuhteissa havaittu. On kuitenkin ollut viitteitä siitä, että SlpC-proteiinia saatetaan tuottaa L. brevis -bakteerin muodostamissa biofilmeissä. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli tutkia pintakerrosproteiinien SlpB, SlpC ja SlpD ekspressiotasoja L. brevis -bakteerin eri kasvumuodoissa käyttäen proteomiikan ja molekyylimikrobiologian menetelmiä. Pintakerrosproteiineja tutkittiin sekä irrottamalla pintaproteiinit kemiallisesti SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesiä varten, että analysoimalla entsymaattisesti irrotetut pintaproteiinit LC-MS/MS -menetelmän label-free quantification (LFQ) -sovelluksella. Pintakerrosproteiinigeenien lähetti-RNA-tasoja tutkittiin reverse transcriptase droplet digital PCR (RT-ddPCR) -menetelmällä. Tutkimuksessa havaittiin, että kaikkia kolmea pintakerrosproteiinia SlpB, SlpC ja SlpD ekspressoitiin L. brevis ATCC 14869 -kannassa. Pintaproteiinianalyysin perusteella SlpD oli yleisin pintaproteiini ja sen osuus oli yli kolmasosa kokonaisproteiinimäärästä, kun taas SlpC- ja SlpB-proteiinien osuudet olivat pienempiä. Pintakerrosproteiinit olivat selvästi erotettavissa geelielektroforeesissa. Kaikkien pintakerrosproteiinien lähetti-RNA:ta oli havaittavissa RT-ddPCR-menetelmällä; näistä slpD oli yleisin, kun taas slpB- ja slpC-määrät olivat pienempiä. Biofilmi- ja planktonisissa soluissa oli saman verran eri pintakerrosproteiineja sekä näiden lähetti-RNA:ta. Tässä tutkimuksessa osoitettiin ensimmäistä kertaa SlpC-proteiinin ekspressio L. brevis ATCC 14869 -bakteerissa ja että ekspressiotasot ovat samat sekä biofilmi- että planktonisissa soluissa.

Bacterial surface layers (S-layers) usually consist of a single protein or glycoprotein species and they form the outermost layer of many bacteria. Three S-layer protein genes have been found in Lactobacillus brevis ATCC 14869, but the expression of only two of them, slpB and slpD, has been described in planktonic conditions. Preliminary results have suggested that the third gene, slpC, may be expressed in biofilm cells. The aim of this thesis was to study the expression of S-layer protein genes slpB, slpC and slpD in the different growth modes of L. brevis ATCC 14869. Surface proteins were detached both chemically for SDS-PAGE analysis and enzymatically for surfaceome analysis by LC-MS/MS and label-free quantification (LFQ). Messenger RNA transcript levels of the S-layer protein genes were analyzed by reverse transcriptase droplet digital PCR (RT-ddPCR). The expression of all three S-layer protein genes slpB, slpC and slpD was confirmed in the study. In the surfaceome analysis, SlpD was the most abundant protein detected on the cell surface, representing more than a third of all identified proteins, whereas SlpB and SlpC were less abundant. The S-layer proteins were detected by gel electrophoresis. Transcripts of all three genes were observed; slpD transcript amounts were the highest, whereas slpB and slpC transcript amounts were lower. The S-layer proteins and their transcripts were present in equal amounts in biofilm and planktonic cells. In this study, SlpC expression is demonstrated for the first time in L. brevis ATCC 14869. The expression of slpB, slpC and slpD was at the same level in biofilm and planktonic cells.