β2-integrin-mediated leukocyte mechanotransduction and immune responses

Abstract

Our health is protected by the immune system, which maintains a carefully regulated balance between inflammation and immune suppression. To mediate homeostasis and inflammation, leukocytes continuously patrol the body and therefore operate in a dynamic mechanical landscape. Mechanical information is transduced into the cell via different proteins, including adhesion receptors called β2-integrins. These receptors mediate essential leukocyte processes, including phagocytosis, immune cell trafficking, adhesion under shear flow conditions of the blood stream and immunological synapse formation between antigen presenting cells and T-cells. However, β2-integrins can also restrict inflammatory processes, such as macrophage Toll-like receptor signalling and cytokine expression, as well as dendritic cell maturation and migration. The precise signalling pathways involved in β2-integrin-mediated leukocyte regulation are not yet fully unravelled. β2-integrin activity is regulated via conformational changes. β2-integrin conformational changes are mediated by interactions with cytoplasmic proteins, such as talin, filamin A and kindlin-3. Talin, filamin A and kindlin-3 are sensitive to mechanical forces and respond by changing their conformation. However, the precise roles of these two proteins in regulating β2-integrin mediated immune processes, especially in response to force, have not yet been fully investigated. The aim of this doctoral thesis was to study molecular mechanisms involved in β2-integrin-mediated leukocyte mechanotransduction and immune responses. We investigated the role of filamin A in β2-integrin-mediated primary neutrophil and T-cell adhesive functions using conditional filamin A knockout mice. In neutrophils, filamin A restricts β2-integrin mediated cell spreading and static adhesion. Furthermore, filamin A was found to inhibit neutrophil oxidative burst, but it was required for proper formation of neutrophil extracellular traps. In T-cells, filamin A restricts F-actin content in cells spreading on integrin ligands. Interestingly, filamin A plays a different role in T-cell adhesion than in neutrophils, as it is required for optimal adhesion under shear flow conditions, and for the generation of integrin-mediated traction forces. Furthermore, filamin A is necessary for T-cell homing in vivo and for T-cell trafficking to sites of inflammation. Together the studies therefore revealed a dual role for the mechanosensitive integrin-binding protein filamin A in regulating leukocyte adhesive processes. In dendritic cells, β2-integrins have previously been shown to regulate gene expression, and to restrict cell maturation, migration and dendritic cell-mediated T-cell activation. Here, we used a β2-integrin TTT/AAA knock-in (KI) mouse model, where the β2-integrins/kindlin-3 interaction has been disrupted, which leads to expressed but dysfunctional integrins. The aim of these studies was to identify integrin-mediated signalling pathways regulating the mature dendritic cell phenotype. In our studies, we found that the mechanoresponsive MRTF-A/SRF pathway is downstream of β2-integrins in dendritic cells. Furthermore, this pathway regulates cytoskeletal gene expression, which governs the ability of dendritic cells to adhere and to generate traction forces, but not dendritic cell 3D migration. We subsequently identified novel mechanotransductional mechanisms involved in integrin-mediated dendritic cell programming and function. We discovered a β2-integrin/actin/lamin link in dendritic cells that regulates global histone methylation in these cells, as well as chromatin accessibility and gene expression. Interestingly, targeting this mechanical link leads to a similar mature dendritic cell phenotype as that caused by abolishing β2-integrin function, and can be used to induce better dendritic cell-mediated tumour rejection in vivo. Taken together, these studies outline several β2-integrin mediated leukocyte mechanotransduction pathways, which we demonstrate are relevant for immune system function in vivo. The results highlight the importance of considering and studying how mechanical forces and information impact immune system function. This is especially important in diseases such as cancer and during aging where the mechanical properties of tissues change over time.

Vårt immunsystem består av immunceller som finns i kroppens olika vävnader. Immunsystemet övervakar kroppen och kontrollerar om främmande mikroorganismer tar sig in i kroppen, samt eliminerar dessa. Forskare har hittat många signaler från andra celler och mikroorganismer som reglerar våra immuncellers funktioner. Men vi vet för tillfället inte så mycket om hur vävnaderna där immuncellerna befinner sig, reglerar immuncellernas funktioner. Vår kropp består av många olika sorters vävnader, såsom hud, muskler, blodkärl och ben. Dessa vävnader skiljer sig i fråga om sina mekaniska egenskaper och därmed de mekaniska signaler de förmedlar till immuncellerna i vävnaderna. Till exempel är ben hårdare än muskler, och muskler är hårdare än fett. Blod som pumpas i blodkärlen förmedlar i sin tur en annan sorts mekanisk signal till immunceller, i form av flödeskrafter. Dessa typer av mekanisk information är mycket viktiga för immunceller, som rör sig genom olika vävnader vid en immunrespons. Vid en bakterieinfektion är immunceller som kallas neutrofiler viktiga i början för att kontrollera infektionen. Neutrofiler rekryteras in den infekterade vävnaden från blodet. Immunceller som kallas dendritceller bär information om invaderande patogener från infektionsstället till lymfknutorna. Det här aktiverar T celler i lymfknutorna. Denna process tar 1-2 veckor och under den här tiden är andra immunceller viktiga för att kontrollera infektionen. T celler rör sig sedan från lymfknutorna till infektionsstället via blodströmmen för att bekämpa de invaderande patogenerna. Neutrofiler och T celler tar sig ut från blodströmmen genom att ”ta tag i” proteiner som beklär blodkärlens väggar vid infektionsstället. Denna process kallas adhesion (vidhäftning) och cellerna fäster sig genom att använda sina egna ytproteiner som kallas integriner. Integrinerna sträcker sig från cellens insida till dess utsida. Detta möjliggör att integrinerna kan förmedla mekanisk information från cellens utsida till dess insida och möjliggör att cellen kan reagera på mekanisk information. Vi har nu studerat hur T cellernas och neutrofilernas mekaniska funktioner påverkas av ett protein som kallas Filamin A, som sammanlänkar integrinerna med andra strukturella komponenter inne i cellen. Vi testade hur T celler och neutrofiler som saknar Filamin A proteinet kan fästa sig vid integrinernas ligander (bindningspartners) både i flödesförhållanden och i statiska förhållanden. Dessa experiment visade att Filamin A dämpar neutrofilernas adhesion under statiska förhållanden, men att neutrofilerna behöver Filamin A för att effektivt döda bakterier. I kontrast till situationen i neutrofiler, så behöver T cellerna Filamin A för optimal adhesion i flödesförhållanden och därför också för att ta sig ut ur blodkärlen och in i vävnaderna hos möss. Eftersom dendritceller befinner sig i vävnader, rör de sig inte runt i kroppen via blodkärlen, utan de rör sig istället genom vävnader och lymfkärl. Vid en immunrespons ändrar dendritcellerna sitt beteende från att vara relativt stationära, adhesiva celler som upptar proteiner från sin omgivning, till ett migrationsbeteende, varvid de rör sig till lymfkuntorna dit de upptagna proteinerna transporteras. Man vet inte hur dendritcellerna kan växla mellan dess två typer av beteenden och vilka molekyler inne i cellerna som medverkar i denna process. Eftersom integriner släcks av och/eller minskar när denna förändring i beteende sker, släckte vi av integrinerna permanent i dendritceller och följde med hur cellerna förändrades när integrinerna inte längre fungerar. Vi fann att en signaleringsrutt i dendritcellerna, MRTFA/SRF rutten, stängdes av som ett resultat, och att denna rutt reglerar dendritcellernas förmåga till adhesion. Däremot reglerar denna rutt inte cellens kapacitet till migration. Istället fann vi att vi kan starta migrationsprogrammet i dendritceller genom att upplösa en mekanisk länk mellan integrinet och cellkärnan. När denna länk störs, leder det till att kromatinet öppnar sig, och till förändringar i gentranskription. När länken upplöstes, blev dendritcellerna bättre på att aktivera T celler. I slutändan ledde detta till att dendritcellerna blev bättre på att aktivera immunresponsen mot tumörer i möss. I våra studier har vi sett att proteinet Filamin A, som länkar samman integrinerna med cellens inre strukturer, är viktigt för många av immuncellernas mekaniska och immunologiska funktioner, i både T celler och neutrofiler. Vi har också visat, att när dendritceller fäster sig vid sin omgivning, aktiveras en integrin-beroende signaleringsrutt som förstärker dendritcellernas adhesiva beteendeprogram. När man istället upplöser en mekanisk länk mellan integrinet och cellkärnan, startar man cellens migrationsprogram. Denna mekanism kan man manipulera, vilket leder till bättre immunförmedlad tumöravstötning hos möss. Våra studier har därför lett till en ökad förståelse för hur mekanisk information överförs inne i immunceller, vilka proteiner, signaleringsrutter och molekylära mekanismer som medverkar i dessa processer, och vilka av immuncellernas funktioner regleras av dess mekanismer.