High‐content imaging and structure‐based predictions reveal functional differences between Niemann‐Pick C1 variants

Show simple item record

dc.contributor Helsingin yliopisto, Lääketieteellinen tiedekunta fi
dc.contributor University of Helsinki, Faculty of Medicine en
dc.contributor Helsingfors universitet, Medicinska fakulteten sv
dc.contributor.author Vanharanta, Lauri
dc.contributor.author Peränen, Johan
dc.contributor.author Pfisterer, Simon
dc.contributor.author Enkavi, Giray
dc.contributor.author Vattulainen, Ilpo
dc.contributor.author Ikonen, Elina
dc.date.issued 2020
dc.identifier.uri URN:NBN:fi:hulib-202005142101
dc.identifier.uri http://hdl.handle.net/10138/314929
dc.description.abstract LDL-peräisen kolesterolin solunsisäinen kuljetus on riippuvaista NPC1-nimisen proteiinin toiminnasta lyso- somien kalvorakenteissa. Kyseistä proteiinia koodaavassa geenissä esiintyvät NPC1-proteiinin normaalin toi- minnan estävät geenimutaatiot aiheuttavat hankalan kolesterolikertymäsairauden, joka ilmenee tyypillisesti hermosolujen rappeumana johtaen ennenaikaiseen kuolemaan lapsuusiässä. Ihmisen NPC1-proteiinia koodaava geeni on hyvin heterogeeninen. Osa tämän geenin sisältämistä geenimuunnoksista tiedetään haitattomiksi poly- morfioiksi, mutta osalla NPC1-taudin kantajista ja NPC1-potilaista on geenissään muutoksia, joiden toiminnal- linen merkitys on epäselvä. Eri tutkimuslaboratorioiden välillä jaettu NPC1 cDNA-konstrukti, joka tunnetaan nimellä NPC1 Wild-Type Variant (WT-V) ja, jota on käytetty villityyppi-NPC1 vertailunäytteenä monissa tut- kimuksissa, sisältää myös tiettyjen aminohappojen muutoksia verrattuna Genbankissa julkaistuun NPC1 viite- sekvenssiin. Havainnoidaksemme paremmin pieniä toiminnallisia eroavaisuuksia NPC1-varianttien välillä, ge- neroimme stabiilisti NPC1-poistogeenisessä taustassa AAVS1 safe-harbor-lokuksesta NPC1-variantteja eks- pressoivia ihmissoluja käyttäen CRISPR/Cas9-tekniikkaa. Tämän jälkeen hyödynsimme automaattista kuvanta- mista ja automaattista kuva-analyysia arvioidaksemme kvantitatiivisesti LDL:n indusoimaa muutosta lyso- somien kolesterolimäärässä ja rasvapisaroiden muodostumisessa. Tuloksemme osoittavat, että NPC1 WT-V konstruktin sisältämä L472P-aminohappomuutos heikentää NPC1-proteiinin toimintaa lysosomaalisen koleste- rolin kuljetuksessa. Atomistiset simulaatiot vihjaavat, että L472P-mutaatio kiertää NPC1-proteiinin kahden lu- minaalisen toiminnallisen osan asentoa toistensa suhteen ja hajottaa hiljattain karakterisoidun kolesterolinsiirto- tunnelin. Nämä tulokset paljastavat toiminnallisen vian NPC1 WT-V proteiinissa ja korostavat simulaatioiden, kvantitatiivisen kuvantamisen ja stabiilin proteiiniekspression merkitystä proteiinien toiminnallisten muutosten osoittamisessa. fi
dc.description.abstract The human Niemann-Pick C1 (NPC1) gene encoding a 1278 amino acid protein is very heterogeneous. While some variants represent benign polymorphisms, NPC disease carriers and patients may possess rare variants, whose functional importance remains unknown. An NPC1 cDNA construct known as NPC1 wild-type variant (WT-V), distributed between laboratories and used as a WT control in several studies, also contains changes regarding specific amino acids compared to the NPC1 Genbank reference sequence. To improve the dissection of subtle functional differences, we generated human cells stably expressing NPC1 variants from the AAVS1 safe-harbor locus on an NPC1-null background engineered by CRISPR/Cas9 editing. We then employed high-content imaging with automated image analysis to quantitatively assess LDL-induced, time-dependent changes in lysosomal cholesterol content and lipid droplet formation. Our results indicate that the L472P change present in NPC1 WT-V compromises NPC1 functionality in lysosomal cholesterol export. All-atom molecular dynamics simulations suggest that the L472P change alters the relative position of the NPC1 middle and the C-terminal luminal domains, disrupting the recently characterized cholesterol efflux tunnel. These results reveal functional defects in NPC1 WT-V and highlight the strength of simulations and quantitative imaging upon stable protein expression in elucidating subtle differences in protein function. en
dc.language.iso eng
dc.publisher Helsingin yliopisto fi
dc.publisher University of Helsinki en
dc.publisher Helsingfors universitet sv
dc.subject cholesterol transport
dc.subject Niemann-Pick C1
dc.subject lysosomal storage diseases
dc.subject late endosomes
dc.subject lipid droplets
dc.subject gene variants
dc.title High‐content imaging and structure‐based predictions reveal functional differences between Niemann‐Pick C1 variants en
dc.type.ontasot pro gradu -tutkielmat fi
dc.type.ontasot master's thesis en
dc.type.ontasot pro gradu-avhandlingar sv
dct.identifier.urn URN:NBN:fi:hulib-202005142101

Files in this item

Files Size Format View
Vanharanta_Lauri_Tutkielma_2020.pdf 23.55Mb application/pdf View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show simple item record