The Use of Culture-Independent epicPCR to Determine the Host Range of Antimicrobial Resistance Genes in Manure and Manure-Fertilized Soils in Finnish Dairy Farms

Abstract

Eläintuotannossa käytettävien mikrobilääkkeiden on osoitettu lisäävän antibioottiresistenssigeenien esiintyvyyttä tuotantoeläinten mikrobiomeissa. Lannan käyttö lannoitteena on olennaista maataloudessa, mutta se levittää antibioottiresistenssigeenejä maatilaympäristöön. Maaperässä resistenssigeenit voivat siirtyä horisontaalisesti ympäristöbakteereille. Mikrobilääkeresistenssin leviämistä pyritään hillitsemään rajoittamalla mikrobilääkkeiden käyttöä eläimillä. Sen vuoksi ARG dynamiikkaa on tärkeää tutkia maissa, joissa mikrobilääkkeiden käyttö on rajoitettua. Mikrobilääkkeiden käytön lisäksi myös lannan levitysmäärät ovat tiukasti säänneltyjä suomalaisessa maitokarjataloudessa, minkä vuoksi suomalaiset maitotilat ovat sopivia antibioottiresistenssin leviämisen tutkimiseen maatalouskäytäntöjen funktiona. Tämän tutkimuksen päätavoitteena oli määrittää mitkä bakteerit kantavat kolmea antibioottiresistenssigeeniä ilman kasvatusta käyttäen epicPCR-menetelmää ja siten edistää ymmärrystä mikrobilääkeresistenssistä maatalousympäristöissä. Lanta- ja maanäytteitä kerättiin kahdelta suomalaiselta maitotilalta bakteerisolujen eristystä varten. Aminoglykosidi (strB), beeta-laktaami (blaOXA-58) ja tetrasykliini (tetM) -resistenssigeenit yhdistettiin fylogeneettisella tunnistusgeeniä käyttäen isäntäbakteereihin epicPCR menetelmää käyttämällä. Tuloksia verrattiin koko bakteeriyhteisöön. Kaikkiaan 664 OTU:a yhdistettiin tutkittuihin geeneihin. strB ja tetM jakoivat kuusi isäntäsukua ja kolmen suvun todettiin kantavan kaikkia tutkittuja geenejä. tetM:n yleisimmät isäntäsuvut olivat Escherichia-Shigella, Sedimentibacter ja Fibrobacter. blaOXA-58 geenin yleisimmät isännät olivat Sphingobacterium ja Acinetobacter. Acinetobacter, Pseudomonas ja Psychrobacter kantoivat strB geeniä kaikissa tutkituissa näytteissä. EpicPCR:ää käytettiin ensimmäistä kertaa määrittämään lanta- ja maaperäyhteisöjen antibioottiresistenssigeenien isäntäkirjoa ja tämä työ tarjosi samalla arvokasta tietoa suhteellisen uuden menetelmän edelleen kehittämiseksi.

The use of antimicrobials in livestock production has shown to increase the abundance of antibiotic resistance genes (ARGs) in animal microbiomes. The use of manure as a fertilizer is essential in animal agriculture, however, manure application disseminates ARGs to the farm environment. In soil, the ARGs could be horizontally transferred to the environmental bacteria. Antimicrobial resistance is currently mitigated by limiting the use of antimicrobials for animals; thus, it is important to examine the ARG dynamics in countries where antimicrobial use is restricted. In addition to the antimicrobial use, also manure application rates are tightly regulated in Finnish dairy farming, offering suitable sites for examining the transmissions of ARGs in response to agricultural practices. The main aim of this study was to determine the host range of three antibiotic resistance genes by culture-independent epicPCR to understand the fate of antimicrobial resistance in agricultural environments. The cells were extracted from manure and soil samples taken from two Finnish dairy farms. Aminoglycoside (strB), beta-lactam (blaOXA-58) and tetracycline (tetM) resistance genes were linked with a phylogenetic marker gene to determine the host bacteria using epicPCR. Results were compared to the total bacterial community. In total, 664 OTU’s were linked to ARGs. Antibiotic resistance genes strB and tetM shared six host genera and three genera were found to carry all the studied genes. The most common host genera for tetM were Escherichia-Shigella, Sedimentibacter and Fibrobacter. For blaOXA-58, the most common hosts were Sphingobacterium and Acinetobacter. Acinetobacter, Pseudomonas and Psychrobacter carried strB genes in all studied samples. For the first time the host range of ARGs in manure and soil communities were determined by epicPCR, providing also valuable information for further improving comparatively new method.