Leaf endophytic bacteria in Plantago lanceolata and the effects of soil and maternal genotype on the endophyte community

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-202007033577
Title: Leaf endophytic bacteria in Plantago lanceolata and the effects of soil and maternal genotype on the endophyte community
Author: Lassila, Joose
Other contributor: Helsingin yliopisto, Bio- ja ympäristötieteellinen tiedekunta
University of Helsinki, Faculty of Biological and Environmental Sciences
Helsingfors universitet, Bio- och miljövetenskapliga fakulteten
Publisher: Helsingin yliopisto
Date: 2020
Language: eng
URI: http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-202007033577
http://hdl.handle.net/10138/317417
Thesis level: master's thesis
Degree program: Kasvibiologian maisteriohjelma
Master's Programme in Plant Biology
Magisterprogrammet i växtbiologi
Specialisation: ei opintosuuntaa
no specialization
ingen studieinriktning
Abstract: Tässä tutkielmassa tarkastelen heinäratamon (Plantago lanceolata) lehtien endofyyttibakteereita. Työn ensimmäinen tavoite oli saada yleiskäsitys heinäratamon lehtiendofyyttien monimuotoisuudesta kartoittamalla eri bakteerisukujen esiintyminen heinäratamossa. Lisäksi pyrin selvittämään bakteeriyhteisöön vaikuttavia tekijöitä, erityisesti kasvin genotyypin sekä kasvualustan vaikutusta. Tarkoitukseni oli selvittää, onko löydettävissä viitteitä endofyyttibakteerien vertikaalisesta periytymisestä sukupolvelta toiselle siementen mukana ja vaikuttaako kasvualusta, erityisesti kasvualusta luonnollinen mikrobisto, endofyyttiyhteisöön. Selvitin asiaa eristämällä kasvien lehdistä DNA:ta ja monistamalla siitä bakteeri-DNA:n jaksoja. Tarkoitukseni oli verrata äitikasvien lehtien endofyyttejä siemenistä itäneiden jälkeläisten lehtien endofyytteihin sekä verrata erilaisessa maakäsittelyssä kasvatettujen kasvien endofyyttiyhteisöjä. Lisäksi pyrin selvittämään, miten kasvualusta vaikuttaa heinäratamon siementen itämiseen ja kasvien kasvuun. Keräsin heinäratamon siemeniä Ahvenanmaalta populaatiosta, joka on osa pitkäaikasta 90-luvulla aloitettua metapopulaatiotutkimusverkostoa. Alkukesästä merkitsin maaston 21 kasviyksilöä (äitikasvit) ja keräsin niistä lehtinäytteitä. Loppukesästä keräsin samoista kasviyksilöistä uudet lehtinäytteet sekä siemeniä. Samalla keräsin populaation ympäristöstä myös maa-ainesta. Siemenillä suoritin Helsingissä Viikissä kasvatuskokeen. Kasvatin osan siemenistä kahdesti autoklavoidussa hiekassa (”steriili maa”) ja toisen osan kahdesti autoklavoidussa hiekassa, johon sekoitin luonnosta keräämääni maa-ainesta (”luonnollinen maa”). Ennen kasvatuksen alkua pintasteriloin kaikki siemenet ja sitten kylvin jokaisen niistä omaan kasvatuspurkkiinsa ja asetin purkit kasvatuskaappiin. Kasvatuksen aikana tarkkailin kasvien itämistä ja mittasin lehtien kasvua. Kasvatuksen lopussa otin kaikista kasveista lehtinäytteet ja pintasteriloin ne poistaakseni mahdolliset epifyyttiset mikro-organismit. Samoin pintasteriloin äitikasveista otetut lehtinäytteet. Seuraavaksi eristin näytteistä DNA:ta ja monistin PCR:llä DNA:sta tiettyjä alueita prokaryoottisesta 16S rDNA -geenistä, jota käytetään laajasti bakteerien taksonomisessa ryhmittelyssä. Eristetyt sekvenssipätkät ryhmittelin operatiivisiin taksonomisiin yksiköihin (OTU) ja vertasin niitä SILVA tietokantaan taksonomian selvittämiseksi. Koska myös eukaryoottisten eliöiden mitokondrioissa ja kloroplasteissa on 16S rDNA -alueita, niiden geenit voivat vaikeuttaa endofyyttibakteerien tutkimista. Tämä muodostui ongelmaksi myös tässä tutkielmassa. Yli 86 % kaikista monistamistani sekvenssipätkistä oli peräisin heinäratamon mitondrioista ja yli 12 % heinäratamon kloroplasteista. Vain hieman yli yksi prosentti oli bakteerialkuperää. Tämä käytännössä katsoen esti endofyyttiyhteisön luotettavan tarkastelun. Analysoin siitä huolimatta havaitut bakteeriyhteisöt, joskin tuloksia voidaan pitää lähinnä suuntaa antavina ja niihin on syytä suhtautua äärimmäisellä varovaisuudella. Bakteerisekvenssit jakautuivat 218 taksonomiseen yksikköön, jotka edustivat 71 erilaista bakteerisukua. Kuusi yleisintä sukua muodosti yli 83 % kaikista bakteerisekvensseistä. Useimmat näistä kuudesta suvusta, eritysesti Shewanella-, Ralstonia- ja Halomonas-suvut olivat selkeästi kontaminantteja eivätkä aitoja endofyyttejä. Tein yhteisöanalyysin 65:llä vähemmän yleisellä bakteerisuvulla. Käytin analyysissä Bray-Curtis -dissimilariteetti-indeksiä ja Analysis of Similarities (ANOSIM) -testiä. Havaitsin tilastollisesti merkitsevän eron eri maakäsittelyjen välillä (P = 0.014, R = 0.3787) sekä eri kasvatuskaappien välillä (P = 0.011, R = 0.5493). En löytänyt merkkejä genotyypin vaikutuksesta bakteeriyhteisöön. Siten en havainnut merkkejä myöskään endofyyttien vertikaalisesta periytymisestä äitikasveilta jälkeläisille. Kasvatuskokeen tulokset osoittivat, että itämisprosetti oli kaikilla genotyypeillä merkitsevästi matalampi luonnollisessa maassa kasvatetuilla siemenillä kuin steriilissä maassa kasvatetuilla (F = 10.78, P = 0.0012). Toisaalta luonnollisessa maassa kasvit kasvoivat suuremmiksi kuin steriilissä maassa (F = 10.91, P < 0.0001). Analyysimenetelmien validointi olisi äärimmäisen tärkeää mahdollisissa jatkotutkimuksissa tästä aiheesta. Ennen suuren mittakaavan sekvensointia olisi syytä varmistaa, että mitokondrio- ja klorplastigeenit saadaan tehokkaasti poistettua analyyseistä. Tämän pitäisi onnistua PCR-tuotteiden kokofraktioinnilla, jolloin saattaisi olla mahdollista saada luotettavampi kuva bakteeriyhteisöstä. Tämä avaisi kiehtovia mahdollisuuksia tutkia endofyyttien ja isäntäkasvien koevoluutiota ja ympäristötekijöiden vaikutusta endofyytteihin ja toisin päin. Vaikka havaitsin joitain eroja eri käsittelyjen bakteeriyhteisöissä, on tämän tutkielman tuloksiin suhtauduttava hyvin varovasti ja korkeintaan suuntaa-antavina.The aim of this study was to examine the leaf endophytic bacteria in Plantago lanceolata. The first aim was to get a comprehensive picture of the bacterial diversity, by screening for the different bacterial genera inside the leaves. Furthermore, I aimed to examine the effect of soil and maternal genotype on the endophytic community within P. lanceolata leaves and search for clues of vertical inheritance of endophytes from parent to offspring via seeds. I studied the endophytic bacteria by extracting DNA from the plant leaves and by trying to amplify any bacterial DNA present to get a view of the bacterial diversity in the leaves. My aim was to compare the bacterial community of the mother plants to that of their offspring and also to compare the bacterial communities of plants grown in different soil conditions. Furthermore, I tried to study how the soil conditions affect the growth of P. lanceolata seedlings. I collected seeds and leaf samples of P. lanceolata from Åland, Southwestern Finland, from a population that is part of the ongoing long-term metapopulation research started in Åland in the early 90’s. I marked 21 plant individuals (hereafter referred to as the “mother plants”) in the field in June, when collecting the first leaf samples. In August I collected all seeds from the same plant individuals and a second set of leaf samples. I also collected soil samples from the same location. With the seeds collected from the wild population I executed a growth experiment in Viikki, Helsinki. I grew one set of seeds in twice autoclaved sand (hereafter referred to as the “sterile soil”) and another set in twice autoclaved sand mixed with soil collected from the Åland population (hereafter referred to as the “environmental soil”). I surface sterilized all seeds and then sowed each in their own growth pot and placed them in a growth chamber. During the experiment I took measurements of the leaves. At end of the growth experiment, I took samples of the leaves and surface sterilized them to exclude any epiphytic microorganisms from the analysis. I also surface sterilized the leaf samples taken from the mother plants. I then extracted DNA from the leaf samples and run PCR to amplify certain regions of the bacterial 16S rDNA gene, that is widely used in bacterial taxonomy. The obtained DNA reads where then clustered into Operational Taxonomic Units (OTUs) and assigned taxonomy using SILVA reference database. Mitochondria and chloroplasts of eukaryotic organisms also harbour 16S rDNA regions, so the challenge of studies looking at endophytic bacteria is to exclude the 16S regions of mitochondria and chloroplasts. This proved to be a problem in my study also. More than 86% of all DNA reads obtained turned out to be from P. lanceolata mitochondria and more than 12% from P. lanceolata chloroplasts. Only a bit more than 1% of the reads were eubacterial. This effectively hindered reliable analysis of the endophyte community. I nevertheless analysed the observed eubacterial diversity although the results must be taken as only preliminary and with utmost caution. The eubacterial reads clustered into 218 OTUs, representing 71 different bacterial genera. Six most common genera constituted over 83% of eubacterial reads. Most of these bacteria, most notably Shewanella, Ralstonia and Halomonas, could be identified as being clearly contaminants and not real endophytes. For the 65 less common bacterial genera I performed community analysis using Bray-Curtis Dissimilarity index and Analysis of Similarities (ANOSIM). The results showed that there was a significant difference between the different soil treatments (P = 0.014, R = 0.3787) and also between the two growth chambers (P = 0.011, R = 0.5493). I found no effect of maternal genotype on the bacterial community. Therefore, I observed no sign of vertical inheritance of endophytes. The growth experiment results showed that germination percentage was significantly lower in the environmental soil than in the sterile soil for all genotypes (F = 10.78, P = 0.0012). However, seedling in the environmental soil grew bigger than the seedlings in the sterile soil (F = 10.91, P < 0.0001). For future studies on similar topics, validating molecular methods before large scale sequencing could yield more reliable results. Size fractionating the DNA products of the first PCR round could exclude most mitochondrial sequences and hence allow better analysis of endophytes. This would enable studying interesting questions on coevolution and ecology of host-endophyte interactions. Although I did find some differences in the bacterial communities of different treatments, these results must be considered with caution and as only preliminary.
Subject: Plantago lanceolata
Åland
microbiome
bacteria
endophytes
plants
coevolution


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
Lassila_Joose_Pro_Gradu_2020.pdf 1.680Mb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record