In situ fortification of vitamin B12 in grain materials by fermentation with Propionibacterium freudenreichii

Abstract

Vitamin B12 is a micronutrient that is predominantly present in food of animal origin. Therefore, developing plant-origin food with a nutritionally relevant content of vitamin B12 can increase the dietary intake of this vitamin among people with limited consumption of animal products. Since its chemical synthesis is overly complicated and expensive, the commercial vitamin B12 used for food fortification is exclusively produced via a biotechnological process. As compared to fortification with this commercial form of vitamin B12, in situ fortification via fermentation can be a more cost-effective alternative. As a commonly consumed staple food, grains are excellent vehicles for enrichment with micronutrients. Propionibacterium freudenreichii is the only food-grade microorganism with the ability to produce vitamin B12. Because P. freudenreichii has a low growth rate and is sensitive to acidic conditions, sterilized grain materials have mostly been used so far to produce a high vitamin B12 content. The sterilization process, however, alters the technological properties of grain-based raw materials and decreases the feasibility of the process. The present thesis focuses on in situ fortification of vitamin B12 in native grain materials by fermentation with P. freudenreichii.

This study has demonstrated that fermentation of wheat flour, whole-wheat flour and wheat bran with P. freudenreichii resulted in a physiologically significant level of vitamin B12 (up to 155 ng/g dw) after 7 days. Whole-grain wheat flour and wheat bran had a higher content of vitamin B12 than refined wheat flour. However, the propagation of Enterobacteriaceae indicated that monoculture fermentation with P. freudenreichii cannot dominate the microflora, to guarantee microbial safety and control endogenous microbiota present in grain materials.

Thus, an effective co-culture of Lactobacillus brevis ATCC 14869 and P. freudenreichii was established through a pre-screening to ensure microbial safety. During co-fermentation in wheat bran, P. freudenreichii produced a high level of vitamin B12 (ca. 183 ng/g dw on day 3). Moreover, controlling pH during fermentation could greatly enhance the vitamin B12 production (up to 332 ng/g dw on day 3). Meanwhile, L. brevis showed a strong inhibition on the propagation of Enterobacteriaceae during fermentation, as expected.

The wider applicability of the established co-culture was demonstrated by fermenting 11 types of grain materials, including cereals, pseudocereals and legumes, with P. freudenreichii and L. brevis. P. freudenreichii produced a nutritionally significant level of vitamin B12 in most of the grain materials. The highest production was found in the rice bran (ca. 742 ng/g dw), followed by the buckwheat bran (ca. 631 ng/g dw), after fermentation. Meanwhile, the addition of L. brevis was able to dominate indigenous microbes during fermentation and thus greatly improve microbial safety during the fermentation of different grain materials.

Overall, this thesis demonstrates that the fermentation of grain materials with P. freudenreichii and an appropriate co-culture, such as L. brevis, is a promising way to provide vitamin B12 in non-sterilized grain-based materials, without compromising microbial safety. Meanwhile, selecting raw materials that provide optimal conditions for P. freudenreichii can significantly improve the efficacy of vitamin B12 synthesis.

B12-vitamiinia esiintyy pääasiassa vain eläinperäisissä elintarvikkeissa. Tämän vuoksi on tärkeää kehittää B12-vitamiinia sisältäviä kasviperäisiä elintarvikkeita kuluttajille, jotka syövät vähän tai eivät lainkaan eläinperäisiä tuotteita. Koska B12-vitamiinin syntetisointi kemiallisesti on erittäin monivaiheinen ja kallis prosessi, elintarvikkeiden täydentämiseen käytetty vitamiini tuotetaan yksinomaan teollisesti mikrobien avulla. B12-vitamiinin tuottaminen suoraan elintarvikkeeseen in situ voisi kuitenkin olla taloudellisempi vaihtoehto. Yleisesti käytettävät viljamateriaalit ovat hyviä kasvatusalustoja mikrobeille, joiden tiedetään tuottavan tiettyjä bioaktiivisia yhdisteitä, kuten vitamiineja. Propionibacterium freudenreichii on ainoa elintarvikekäyttöön hyväksytty mikro-organismi, jolla on kyky tuottaa B12-vitamiinia. Tämän väitöskirjatyön tavoite oli tutkia B12-vitamiinin tuottamista in situ viljapohjaisiin alustoihin P. freudenreichii -bakteerin avulla.

Tutkimuksessa osoitettiin, että valkoisten ydinvehnäjauhojen, kokojyvävehnäjauhojen ja vehnäleseen fermentointi P. freudenreichii –bakteerilla tuotti merkittävän määrän B12-vitamiinia seitsemän päivän aikana. Fermentointi yksinomaan propionibakteerilla ei kuitenkaan pystynyt estämään täysin joidenkin haitallisten bakteereiden kasvua ja siten takaamaan tuotteen mikrobiologista turvallisuutta. Kun vehnäleseen fermentointiin käytettiin samanaikaisesti sekä P. freudenreichii -bakteeria että Lactobacillus brevis –maitohappobakteeria, havaittiin L. breviksen estävän tehokkaasti haitallisten bakteerien kasvua. Kehitetyn P. freudenreichiin ja L. breviksen yhteisviljelyn vaikutusta B12-vitamiinin tuottoon ja mikrobiologiseen laatuun tutkittiin vehnän lisäksi 11 erilaisella vilja-, pseudovilja- ja palkokasvimateriaalilla. P. freudenreichii tuotti B12-vitamiinia useimmissa materiaaleissa ravitsemuksellisesti merkittäviä määriä. Eniten P. freudenreichii tuotti B12-vitamiinia riisileseessä ja seuraavaksi eniten tattarileseessä kolmen päivän fermentoinnin aikana. Lisäksi todettiin, että L. breviksen vaikutuksesta tuotteiden mikrobiologinen laatu säilyi hyvänä.

Tämä väitöskirjatyö osoitti, että fermentointi käyttäen P. freudenreichii -bakteeria yhdessä L. brevis -maitohappobakteerin kanssa on lupaava menetelmä tuottaa B12-vitamiinia viljapohjaisiin materiaaleihin ilman, että tuotteen mikrobiologinen laatu heikkenisi. Lisäksi tässä tutkimuksessa todettiin, että B12-vitamiinin optimaaliseen tuottoon vaikuttaa suuresti lähtömateriaalin koostumus.