c-Jun and its targets in fibrosarcoma and melanoma cells

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-51-6659-3
Title: c-Jun and its targets in fibrosarcoma and melanoma cells
Author: Kielosto, Mari
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Biological and Environmental Sciences
Doctoral Programme in Integrative Life Science
University of Helsinki, Faculty of medicine, Department of pathology
Publisher: Helsingin yliopisto
Date: 2020-11-06
Language: en
URI: http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-51-6659-3
http://hdl.handle.net/10138/319866
Thesis level: Doctoral dissertation (article-based)
Abstract: c-Jun, a member of the AP-1 transcription factor family, is involved in numerous cell activities such as proliferation, differentiation, tissue morphogenesis, tumorigenesis, and apoptosis. c-Jun is a basic leucine zipper (bZIP) transcription factor that can form homodimers and heterodimers with other AP-1 family members. As a dimer, it is able to bind to DNA and regulate transcription of different genes. Numerous extracellular stimuli, such as ultraviolet (UV) radiation, and cellular stimuli, such as reactive oxygen species (ROS), induce signaling cascades leading to phosphorylation and activation of c-Jun. The main kinase phosphorylating c-Jun is c-Jun N-terminal kinase (JNK). c-Jun is constitutively activated in many human cancers, including melanoma, breast, pancreatic, and colorectal cancers, and transformed cell lines, like Ha-ras transformed fibroblasts. Thus, better knowledge of the activation of c-Jun and the genes it regulates in cell transformation is needed in the fight against cancer. The aim of this study was to clarify the role of c-Jun in cell transformation by using fibrosarcoma and melanoma cells as models. In the first part of the study, the significance of phosphorylation and activation of c-Jun in S-adenosylmethionine decarboxylase (AdoMetDC)-, ornithine decarboxylase (ODC)-, and Ha-ras oncogene-transformed mouse fibroblasts (Amdc, Odc, and E4 cells, respectively) was examined by exploiting transactivation domain deletion mutant of c-Jun (TAM67) and phosphorylation-deficient c-Jun mutants. Further, the upstream kinases of c-Jun were evaluated by using dominant negative mutants of SEK1 (MKK4) and JNK1 as well as JNK inhibitors. The transformed morphology of the cells was reversed with differing efficacies when transfected with these mutants, most effectively when using TAM67. Due to the highest potency of TAM67, Amdc, Odc, and E4 cells carrying a tetracycline-inducible expression system of TAM67 were then generated (Amdc-, Odc-, and E4- pLRT-TAM67 cell lines). These inducible cell lines provide good, reversibly regulatable models to identify the mechanisms of c-Jun-related transformation. Indeed, expression of TAM67 inhibited cell growth in soft agar and three-dimensional (3D) Matrigel matrix, and, most importantly, tumor formation in nude mice. In the second part of the study, the transformation-relevant genes regulated by c-Jun in Amdc, Odc, and E4 cells were identified by utilizing the above-mentioned cell lines (Amdc-, Odc-, and E4-pLRT-TAM67). After TAM67 induction, the differentially expressed genes in the morphologically normalized cells compared with the transformed cells were identified by Incyte Genomics’ cDNA microarray analysis. Relatively few changes were identified, including those of integrins alpha 6 and beta 7 (ItgA6 and ItgB7), which were upregulated in transformed cells, and lysyl oxidase (Lox), which was downregulated. In addition to Lox, also Lox-like-1 and 3 were found to be downregulated in Odc and E4 cells by Affymetrix’s microarray and RT-PCR analyses. In the third and fourth parts of the study, the functional roles of the up- and downregulated genes were examined. ItgA6 was found to pair mainly with ItgB1 to form integrin alpha 6 beta 1 heterodimer, and function-blocking antibodies against ItgA6 or ItgB1 inhibited the binding of Amdc cells to laminin and cell invasion in 3D Matrigel. Importantly, similar results were seen with human HT-1080 fibrosarcoma cells. Further, downregulated Lox (pro-LOX) was observed to be involved in the invasion of Odc cells. In addition to fibrosarcoma cells, the expressions of LOX family members were also examined in different human melanoma cell lines, where they were variably expressed. LOXL2 and LOXL3 were upregulated in nearly all melanoma cell lines studied. Upregulated LOX family members and their activities were found to be associated with invasion in melanoma cells, especially when co-cultured with fibroblasts in 3D Matrigel. In conclusion, we have demonstrated that the transformed phenotype of ODC-, AdoMetDC-, and Ras-transformed mouse fibroblasts is reversibly regulatable by dominant negative mutants of c-Jun and identified ItgA6 and Lox as transformation-relevant target genes of c-Jun. Inactive pro-LOX is suggested to act as a tumor suppressor in these cells. In human melanoma cells, in turn, active LOX and LOXL2 were identified as molecules promoting invasive growth and could offer potential new targets for therapeutic approaches in melanomas.AP-1 transkriptiotekijäperheen jäsen c-Jun osallistuu lukuisten solutoimintojen, kuten solujen lisääntymisen, erilaistumisen, tuumorigeneesin ja apoptoosin säätelyyn. Lukuisat solun ulkopuoliset ja sisäiset ärsykkeet, kuten UV-säteily ja reaktiiviset happiradikaalit, indusoivat signalointikaskadeja, jotka johtavat c-Jun:n fosforylaatioon ja aktivaatioon. c-Jun on aktivoitunut monissa ihmisen syövissä, kuten melanoomassa, rinta-, haima- ja suolistosyövissä, sekä transformoiduissa solulinjoissa kuten Ha-ras transformoiduissa fibroblasteissa. Syövän vastaisessa taistelussa tarvitaankin parempaa tuntemusta c-Jun:n aktivaatiosta, sekä niistä geeneistä, joita se säätelee pahanlaatuisissa soluissa. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää c-Jun:n merkitystä solujen transformaatiossa käyttämällä mallina fibrosarkooma- ja melanoomasoluja. Tutkimuksen ensimmäisessä osassa c-Jun:n aktivaation ja fosforylaation merkitystä tutkittiin fibrosarkoomasoluissa käyttäen c-Jun:n dominantti-negatiivisia mutantteja, jotka estävät normaalin c-Jun:n toimintaa. Syöpäsolujen muuttunut morfologia palautui tehokkaimmin c-Jun:n mutantilla TAM67, josta puuttuu transaktivaatio-domeeni. Kehitimme työssä solulinjoja, joissa TAM67:n ilmentymistä voitiin reversiibelisti säädellä tetrasykliinillä, muodostaen hyvän mallin tunnistaa c-Jun:iin liittyviä transformaation mekanismeja. TAM67:n ilmentyminen esti näiden solujen kasvua 3D-Matrigeeli-kudosmallissa, ja mikä tärkeintä, kasvainten muodostumista nude hiirissä. Tutkimuksen toisessa osassa identifioitiin c-Jun:n säätelemiä, transformaation kannalta merkityksellisiä geenejä fibrosarkoomasoluissa. Tätä varten geenien ilmentymistä verrattiin transformoituneissa soluissa ennen ja jälkeen TAM67-induktion aiheuttamaa normalisoitumista käyttämällä DNA-mikrosiru- ja RT-PCR-analyysejä. Tulosten perusteella havaitsimme fibrosarkoomassa mm. adheesioreseptori integriini alfa 6:n (ItgA6) ylituottoa ja kollageenin vetolujuutta säätelevän lysyylioksidaasin (Lox) sekä Lox-perheen kahden muun jäsenen (Lox-like-1 ja -3) alituottoa. Tutkimuksen kolmannessa ja neljännessä osassa selvitettiin yli- ja alituotettujen molekyylien toiminnallisia merkityksiä syöpäsoluissa. ItgA6:n tai sen partnerin ItgB1:n toiminnan estäminen vasta-aineilla esti sekä hiiren että ihmisen fibrosarkoomasolujen invaasion 3D-Matrigeelissä. Havaitsimme lisäksi Lox:n (pro-Lox) alituoton olevan merkityksellinen fibrosarkoomasolujen invaasiolle. Melanoomasoluissa LOX-perheen jäsenet ilmentyivät vaihtelevasti, mutta mielenkiintoisesti. LOXL2 ja LOXL3 olivatkin ylituotettuja melkein kaikissa tutkituissa solulinjoissa. Melanoomasoluissa LOX-perheen jäsenten ylituoton (ja toiminnan) havaittiin liittyvän invaasioon, erityisesti kun solut kasvoivat 3D-Matrigeelissä yhdessä fibroblastien kanssa. Yhteenvetona tuloksistamme esitämme, että fibrosarkoomasolujen transformoitunut fenotyyppi on reversiibelisti säädeltävissä c-Jun:n dominantti-negatiivisilla mutanteilla. Lisäksi identifioimme ItgA6:n ja Lox:n olevan transformaatioon liittyviä c-Jun:n kohdegeenejä. Inaktiivisen pro-LOX:n ehdotamme toimivan tuumorisupressorina näissä soluissa. Ihmisen melanoomasoluissa puolestaan havaitsimme, että aktiiviset LOX ja LOXL2 edistävät invasiivista kasvua ja ne voisivat näin olla mahdollisia uusia kohdemolekyylejä melanoomien hoitokokeiluihin.
Subject: syöpä- ja molekyylibiologia
Rights: This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
kielosto_mari_dissertation_2020.pdf 3.590Mb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record