Proteomic Approaches to the Characterization of Tolerance and Virulence in Bacterial Biofilms

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-51-6729-3
Title: Proteomic Approaches to the Characterization of Tolerance and Virulence in Bacterial Biofilms
Author: Miettinen, Ilkka
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Pharmacy, Division of Pharmaceutical Biosciences
Doctoral Programme in Drug Research
Publisher: Helsingin yliopisto
Date: 2020-11-19
Belongs to series: Dissertationes Scholae Doctoralis Ad Sanitatem Investigandam Universitatis Helsinkiensis - URN:ISSN:2342-317X
URI: http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-51-6729-3
http://hdl.handle.net/10138/320292
Thesis level: Doctoral dissertation (monograph)
Abstract: Treatment-resistant bacterial infections pose a major challenge to healthcare. In order to establish a chronic infection, bacteria must tolerate antimicrobial treatment and evade clearance by host immune system. The ability of bacteria to form biofilms, which are sessile communities of adherent microbes encapsulated in self-produced matrix of extracellular polymeric substances, contributes crucially to both of these traits. Biofilm bacteria produce numerous virulence factors that facilitate their adherence, invasion into host tissue, and evasion of the host immune system. Variable microenvironments within the biofilm give rise to metabolically sedentary subpopulations of bacteria, known as persisters, which can transiently tolerate antimicrobial chemotherapy. The biofilm matrix provides additional mechanical barrier against a selection of therapeutics. This thesis presents the optimization and validation of a Staphylococcus aureus model for persistence. Bacteria were monitored past the stationary phase transition to detect metabolic switching and a culture with halted energy metabolism and replication was confirmed to withstand extreme levofloxacin concentrations in a manner that was reversible by resurrecting growth. This model culture was used to study the effect of the metabolic status of the inoculum on biofilm characteristics. A label-free proteomics-based analysis of surface-associated proteins was carried out, and persister model-derived biofilms were shown to display boosted tolerance traits, such as oxidative stress defense and immune evasion, when compared to biofilms created from metabolically active cultures. This was reflected to increased survival in macrophage-like cells. A mixed biofilm model based on S. aureus and Pseudomonas aeruginosa, common co-habitants in chronic wounds and cystic fibrosis lung infections, was also established to study the effect of interspecies interaction on biofilm virulence and tolerance. A label-free proteomics approach was applied to concurrently compare surface-associated and extracellular protein profiles between mono- and co-cultured biofilms. This study provided proteomics-level insight that simultaneously covered multiple facets of virulence and tolerance in mixed-species biofilms. Several of the key findings here were found to be aligned with previously published functional studies. The proteomics studies also involved the compilation and improved annotation of S. aureus and P. aeruginosa theoretical proteomes, which are now fully accessible for future studies involving these or related bacterial strains. Altogether, this work demonstrates the applicability of label-free proteomics approaches in two different, clinically relevant settings involving bacterial biofilms. It also proposes models, methods, and proteomic workflows for the study of bacterial virulence and tolerance.  Hoitoon vastaamattomat bakteeri-infektiot ovat merkittävä haaste terveydenhuollolle. Aiheuttaakseen tällaisen kroonisen infektion bakteerin on selviydyttävä antimikrobilääkehoidosta ja vältyttävä isäntäorganismin puolustusmekanismeilta. Bakteerien kyky muodostaa biofilmejä eli yhteen liittyneiden mikrobien limapeitteisiä yhdyskuntia vaikuttaa ratkaisevasti näihin ominaisuuksiin. Biofilminä elävät bakteerit tuottavat virulenssitekijöitä, jotka mahdollistavat niiden kiinnittymisen ja tunkeutumisen kohdekudokseen sekä suojautumisen isäntäorganismin immuunivasteelta. Elinolosuhteiden vaihtelu biofilmirakenteen eri osissa synnyttää persistereinä tunnetun, aineenvaihdunnallisesti epäaktiivisten osapopulaation, joka kykenee tilapäisesti sietämään antimikrobilääkehoitoa. Biofilmin limapeite tarjoaa lisäksi mekaanisen suojan joitakin antimikrobilääkkeitä vastaan. Tämä väitöskirjatyö esittelee Staphylococcus aureus -bakteeriin perustuvan persisterimallin optimointi- ja validointiprosessin. Bakteerien aineenvaihduntaominaisuuksia seurattiin niiden siirtyessä kasvun tasannevaiheeseen, ja tämän perusteella valitun, energiametabolialtaan alentuneen ja replikoitumattoman viljelmän todettiin olevan vastustuskykyinen äärimmäisille levofloksasiinipitoisuuksille. Herkkyys mikrobilääkkeelle palautui uudelleenkäynnistetyn kasvun myötä. Tätä malliviljelmää käytettiin leimavapaassa pintaproteomiikkamäärityksessä, jossa kartoitettiin siirrosteen aineenvaihduntatilan vaikutusta siitä kasvatettujen biofilmien ominaisuuksiin. Persisterimalliviljelmästä kylvetyn biofilmin havaittiin ilmentävän metabolisesti aktiivista verrokkiaan enemmän vastustuskykyyn liittyviä tekijöitä, kuten happistressin sietoon ja immuunipuolustuksen välttämiseen liittyviä proteiineja. Tämä näkyi myös bakteerin kohonneena kykynä selvitä syöjäsolujen sisällä. S. aureus- ja Pseudomonas aeruginosa -lajeja tavataan usein yhdessä kroonisissa haavainfektioissa ja kystiseen fibroosiin liittyvissä keuhkoinfektioissa. Näitä bakteereita viljeltiin sekabiofilmimallina sen tutkimiseksi, miten lajien välinen vuorovaikutus vaikuttaa niiden virulenssiin ja vastustuskykyyn. Proteiinien ilmenemisprofiileja solupinnoilla ja biofilmin ympäristössä verrattiin puhdas- ja sekaviljelmien kesken leimavapaalla proteomiikkatekniikalla. Kartoitus valotti useita virulenssiin ja sietokykyyn liittyviä ilmiöitä, jotka olivat linjassa aiempien toiminnallisten tutkimusten kanssa. Työtä varten koostettiin lisäksi teoreettiset S. aureus ja P. aeruginosa -proteomit. Nämä annotaatioltaan kohennetut proteomit ovat vapaasti saatavilla myöhempiä, vastaavilla bakteerikannoilla tehtäviä tutkimuksia varten. Kokonaisuutena työ havainnollistaa leimavapaiden proteomiikkamääritysten sovellettavuutta kahdella kliinisesti relevantilla bakteeribiofilmialustalla esitellen samalla malleja, menetelmiä ja työnkulkuja virulenssin sekä sietokyvyn tutkimukseen.
Subject: farmasia (farmaseuttinen biologia)
Rights: This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.


Files in this item

Files Size Format View

There are no files associated with this item.

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record