Non-invasive analysis of liposome protein corona structure and composition in a single label-free workflow

Show simple item record

dc.contributor Helsingin yliopisto, farmasian tiedekunta fi
dc.contributor Helsingfors universitet, farmaceutiska fakulteten sv
dc.contributor University of Helsinki, Faculty of Pharmacy, Division of Pharmaceutical Biosciences en
dc.contributor Lääketutkimuksen tohtoriohjelma fi
dc.contributor Doktorandprogrammet i läkemedelsforskning sv
dc.contributor Doctoral Programme in Drug Research en
dc.contributor.author Kari, Otto
dc.date.accessioned 2020-11-05T16:49:33Z
dc.date.available 2020-11-16
dc.date.available 2020-11-05T16:49:33Z
dc.date.issued 2020-11-26
dc.identifier.uri URN:ISBN:978-951-51-6510-7
dc.identifier.uri http://hdl.handle.net/10138/321150
dc.description.abstract Nanoparticles administered into the body are rapidly covered by biomolecules and assume a biological identity that mediates their biological interactions. Methodological constraints have limited our ability to study the formation of this “protein corona”. To increase our understanding of its formation and evolution in different biological environments, and hence improve the safety and efficacy of nanomedicines, there is a need for non-invasive and label-free methods that better mimic the conditions inside the human body. This thesis describes the development of a novel label-free workflow to determine the structure and composition of the hard and soft corona on liposomes. Multi-parametric surface plasmon resonance is adapted to probe corona structure without interference, including the soft corona of loosely bound proteins. Microfluidics is used to elute the corona subsections for proteomics analysis of their compositions by nanoliquid chromatography tandem mass spectrometry. The in vivo relevance of the method is improved by the use of undiluted biological fluids under dynamic flow conditions. The workflow was applied to the preclinical development of pH-responsive and light- activated liposomes intended for tumour targeting and ocular drug delivery. A novel hyaluronic acid (HA)-coated liposome was also synthesized. The results indicate that thin and sparse monolayer hard coronas form on the liposomes in plasma and vitreous. It is covered by a soft corona of monolayer thickness in plasma, but in vitreous, the soft corona is less defined. Formulation-dependent differences in corona structure and relative protein composition were observed in plasma, and the liposomes clustered based on their surface charge. In vitreous, corona composition was independent of formulation properties. In both environments, there is a high overlap in hard and soft corona compositions, and the most abundant proteins are predominantly hydrophilic and negatively charged irrespective of liposome properties. A common set of surfactant and immune system associated proteins adsorbs in both plasma and vitreous, possibly in response to the high surface free energy of lipid bilayers, labelling them “non-self” lipid particles. However, liposomal lipids induced the enrichment of stealth-mediating proteins in the plasma hard coronas regardless of pegylation. These also enriched in the soft coronas of most other formulations, suggesting that the soft corona is part of the biological identity and modulated by liposome surface properties. Protein-specific, rather than formulation- specific factors, are drivers of protein adsorption in the vitreous, possibly due to the molecular crowding activity of structural HA. Although the HA-coated liposome bound more proteins in vitreous, which may interact with its structural meshwork, corona formation did not significantly influence the vitreal mobility of HA or PEG-coated anionic liposomes. The HA-coating yielded improved plasma stability of the light-activated liposomes with otherwise comparable properties, making it a promising coating for both intravenous and ocular drug delivery applications. The workflow addresses significant methodological gaps in the research field by providing information on truly complementary hard and soft corona compositions together with their in situ structural properties. This is achieved with undiluted biofluids and under dynamic conditions without the use of interfering labels. The first description of vitreal corona formation on drug delivery systems contributes to our understanding of ocular pharmacokinetics. The method was also applied to determine the kinetics of opsonin binding directly on liposomes for the first time. The convenient and easily reproducible workflow is well-suited for the preclinical development of liposomes, and it can be combined with other omics methodologies and adapted to accelerate the preclinical development of different types of nanomedicines. en
dc.description.abstract Nanopartikkelien pinnalle sitoutuu heti elimistöön annostelun jälkeen biomolekyylejä, jotka välittävät niiden biologisia vuorovaikutuksia elimistössä ja luovat siten nanopartikkeleille uuden biologisen identiteetin. Tämän proteiinikoronan rakenteen ja koostumuksen muodostumiseen ja kehittymiseen vaikuttavien tekijöiden tuntemus eri jakautumisvaiheissa on edellytys tehokkaampien ja turvallisempien nanolääkkeiden kehittämiselle, mutta käytössä olevien menetelmien puutteet ovat vaikeuttaneet ilmiön tutkimista. Tutkimusalalla tarvittavien uusien menetelmien tulisi olla leimavapaita ja kajoamattomia. Lisäksi niiden tulisi paremmin mukailla ihmiselimistön olosuhteita (in vivo -relevanssi). Väitöskirjassa kuvataan uuden leimavapaan menetelmäalustan kehitystyö proteiinikoronan tutkimiseen liposomien pinnalla, jonka avulla sen rakennetta ja koostumusta voidaan tutkia herkkää tasapainoa häiritsemättä. Moniparametriseen pintaplasmoniresonanssiin perustuva menetelmä mahdollistaa sekä tiiviisti (”hard corona”) että löyhästi (”soft corona”) nanopartikkelien pinnalle sitoutuneista biomolekyyleistä muodostuneiden kerrosten fysikaalisten rakenneominaisuuksien tutkimisen. Lisäksi mikrofluidistiikan avulla erotellut koronan löyhät ja tiiviit osat analysoidaan nanonestekromatografian sekä tandem-massaspektrometrian avulla, jolloin on mahdollista selvittää koronan osien rakenteellisia ominaisuuksia vastaavat proteiinikoostumukset. Menetelmäalustan in vivo -relevanssia parannettiin mahdollistamalla laimentamattomia biologisia nesteiden käyttö dynaamisissa virtausolosuhteissa. Menetelmäkokonaisuutta hyödynnettiin pH-responsiivisten ja valoaktivoitujen liposomien prekliinisessä kehitystyössä, joissa tavoitteena on kehittää uusia lääkekohdennusjärjestelmiä syöpäsairauksiin sekä silmän takaosan sairauksiin. Työssä kehitettiin myös uusi hyaluronihappo (HA)-pinnoitteinen liposomi. Tulokset osoittivat, että sekä veriplasmassa että silmän lasiaisessa näiden liposomien pinnalle muodostuu ohut, noin yhden proteiinikerroksen paksuinen ja harvarakenteinen tiivis proteiinikorona. Plasmassa liposomien pinnalla havaittiin lisäksi löyhä proteiinikorona, mutta lasiaismittauksissa ei havaittu selvästi erottuvaa löyhää proteiinikoronaa. Proteiinikoronan koostumusten havaittiin olevan plasmassa riippuvaisia liposomien formulaatiosta ja saman pintavarauksen omaavien liposomien koronan koostumuksissa havaittiin yhtäläisyyksiä proteiiniryhmien rikastumisessa. Lasiaisessa sen sijaan ei havaittu yhteyttä liposomien formulaation ja proteiinikoronan osien koostumuksen välillä. Sekä plasmassa että lasiaisessa havaittiin merkittävä yhtäläisyys tiiviin ja löyhän koronassa tunnistettujen proteiinien välillä. Lisäksi koronaan eniten rikastuneet proteiinit olivat molemmissa ympäristöissä valtaosin hydrofiilisia ja negatiivisesti varautuneita, riippumatta liposomien formulaatioista. Lisäksi sekä plasmassa että lasiaisessa liposomien pinnalle sitoutui sama joukko surfaktanttiproteiineja ja immuunijärjestelmän proteiineja, mikä selittyy mahdollisesti liposomien kaksoiskalvopinnan korkeasta vapaasta energiasta, jonka perusteella nämä proteiinit mahdollisesti merkitsevät liposomit elimistölle vieraiksi lipidipartikkeleiksi. Liposomien kaksoiskalvon rakenteellisten lipidien havaittiin kuitenkin samalla edistävän verenkierrosta poistamista ehkäisevien proteiinien rikastumista tiiviiseen plasmakoronaan myös ilman polyetyleeniglykolipinnoitetta (PEG). Näiden proteiinien havaittiin rikastuvan myös useimpien liposomiformulaatioiden löyhään koronaan, mikä osoittaa että myös löyhä korona on osa biologista identiteettiä ja sen koostumukseen plasmassa voidaan vaikuttaa liposomien pintaominaisuuksia muokkaamalla. Sen sijaan lasiaisessa proteiinikoronan muodostumisen ajureina toimivat proteiinien ominaisuudet, mikä selittyy mahdollisesti lasiaisen sisältämän rakenteellisen hyaluronihapon luonnollisesta vaikutuksesta sen sisältämien proteiinien käyttäytymiseen. HA-pinnoitteisen liposomin pinnalle sitoutui mittausten perusteella enemmän proteiinia lasiaisessa verrattuna plasmaan, mitkä voivat lisäksi analyysien perusteella vuorovaikuttaa lasiaisen verkostomaisen tukirakenteen kanssa; lasiaiskoronan muodostumisella ei kuitenkaan havaittu olevan tilastollisesti merkittävää vaikutusta negatiivisesti varautuneiden HA- tai PEG-pinnoitteisten liposomien kulkeutumiseen silmässä. HA-pinnoite paransi valoaktivoitujen liposomien stabiilisuutta plasmassa ja osoittautui muidenkin tutkittujen ominaisuuksien osalta vertailukelpoiseksi pinnoitteeksi yleisesti käytettyyn PEG-pinnoitteeseen verrattuna. HA on siten lupaava uusi pinnoitemateriaali, joka soveltuu sekä laskimoon että silmän sisäisesti annosteltaville lääkekuljettimille. Väitöskirjassa kehitetty menetelmäkokonaisuus vastaa tutkimusalan keskeisiin menetelmäpuutteisiin mahdollistamalla liposomien pinnalle muodostuvan tiiviin ja löyhän proteiinikoronan in situ -rakenteen ja proteiinikoostumuksen tutkimisen ensimmäistä kertaa samasta näytteestä. Mittausten osoitettiin olevan mahdollisia laimentamattomassa, virtaavassa biologisessa nesteessä ilman koronan muodostumista häiritsevien leima-aineiden käyttöä. Työssä julkaistiin ensimmäisen kuvaus proteiinikoronan muodostumisesta lasiaisessa lääkekuljettimien pinnalle, mikä edistää ymmärrystä niiden farmakokineettisestä käyttäytymisestä silmän lasiaisessa. Menetelmää sovellettiin myös onnistuneesti opsoniinien kineettisten parametrien määrittämiseen ensimmäistä kertaa suoraan liposomien pinnalla. Käyttäjäystävällinen ja helposti toistettavat mittaukset mahdollistava menetelmäkokonaisuus soveltuu siten hyvin käytettäväksi liposomien prekliinisessä tutkimuksessa. Siihen voidaan tulevaisuudessa yhdistää muita omics-menetelmiä ja sitä voidaan muokata sovelluksia myös muiden tyyppisten nanolääkkeiden kehitystyön tueksi. fi
dc.format.mimetype application/pdf
dc.language.iso en
dc.publisher Helsingin yliopisto fi
dc.publisher Helsingfors universitet sv
dc.publisher University of Helsinki en
dc.relation.isformatof URN:ISBN:978-951-51-6509-1
dc.relation.isformatof Helsinki: 2020
dc.rights Julkaisu on tekijänoikeussäännösten alainen. Teosta voi lukea ja tulostaa henkilökohtaista käyttöä varten. Käyttö kaupallisiin tarkoituksiin on kielletty. fi
dc.rights This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited. en
dc.rights Publikationen är skyddad av upphovsrätten. Den får läsas och skrivas ut för personligt bruk. Användning i kommersiellt syfte är förbjuden. sv
dc.subject farmaseuttinen nanoteknologia, biofarmasia
dc.title Non-invasive analysis of liposome protein corona structure and composition in a single label-free workflow en
dc.type.ontasot Väitöskirja (artikkeli) fi
dc.type.ontasot Doctoral dissertation (article-based) en
dc.type.ontasot Doktorsavhandling (sammanläggning) sv
dc.ths Urtti, Arto
dc.ths Viitala, Tapani
dc.ths Cerullo, Vincenzo
dc.opn Dawson, Kenneth A.
dc.type.dcmitype Text

Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
kari_otto_dissertation_2020.pdf 5.162Mb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show simple item record