STRUCTURAL AND FUNCTIONAL CHARACTERIZATION OF LEUCINE-RICH REPEAT SYNAPTIC ADHESION MOLECULES

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-51-6828-3
Title: STRUCTURAL AND FUNCTIONAL CHARACTERIZATION OF LEUCINE-RICH REPEAT SYNAPTIC ADHESION MOLECULES
Author: Karki, Sudeep
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Biological and Environmental Sciences
Doctoral Programme in Integrative Life Science
Publisher: Helsingin yliopisto
Date: 2020-12-17
Belongs to series: URN:ISSN:2342-317X
URI: http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-51-6828-3
http://hdl.handle.net/10138/321532
Thesis level: Doctoral dissertation (article-based)
Abstract: Synaptic adhesion molecules play a key role in the regulation of synapse development and maintenance. Several families of leucine-rich repeat (LRR) domain containing synaptic adhesion molecules have been characterized, including synaptic adhesion-like molecules (SALMs), and the LRR transmembrane (LRRTM) proteins. These proteins localize mostly in postsynaptic neurons in excitatory synapses and interact with presynaptic adhesion protein families; neurexin (NRXN) and leukocyte common antigen-related protein tyrosine phosphatases (LAR-RPTPs). Dysfunction of the synaptic adhesion molecules is linked to cognitive disorders, such as autism spectrum disorders and schizophrenia. This thesis work comprises the structural and functional study of SALM3 and SALM5 proteins from the SALM family, and their interaction with PTPσ from the LAR-RPTPs family. In addition, this thesis includes the work on the development of an inhibitory screening assay for synaptic adhesion molecules interactions, here targeting the LRRTM2-NRXN interaction. The SALM family proteins include five members, SALM1-5. We have solved the crystal structures of the mouse SALM5 LRR-Ig, and SALM3 LRR constructs at 3.1 Å and 2.8 Å resolution, respectively. Both the structures show the LRR domain mediating the dimerization, also verified by biophysical studies. We determined the binding affinity of SALM3 and SALM5 as 2-23 µM towards PTPσ, and solved the solution structure of the SALM3-PTPσ complex using small-angle X-ray scattering (SAXS), revealing a 2:2 complex formation similar to that observed for SALM5 and PTP. Based on our structure-function studies, SALM3 dimerization is vital for the SALM3-PTPσ complex to exert synaptogenic activity. We also developed an inhibitor screening method for the adhesion proteins interactions, focusing on the LRRTM2-NRXN interaction. We utilized the AlphaScreen technology to identify inhibitors with moderate IC50-values and established an orthogonal in-cell western blot assay to verify the obtained hits. This paves the way for the future development of high affinity compounds by further high throughput screening of larger compound libraries. The studies conducted in this thesis and the results have contributed to a better understanding of the role of SALM proteins in synapse formation, and possibly these structure-based studies will help to understand their implications in disease. The inhibitor screening assay developed can be adapted towards other synaptic adhesion interactions, and the inhibitors obtained could be used for functional studies, or towards drug discovery.Synapsien ahdeesiomolekyylit ovat keskeisiä aivojen hermosolujen välisten liitosten kehityksessä ja ylläpidossa. Useita leusiiinirikkaita (LRR) toistodomeeneja sisältäviä adheesioproteiiniryhmiä on karakterisoitu, kuten LRRTM ja SALM proteiinit. Nämä proteiinit paikantuvat useimmiten postsynaptisiin neuroneihin eksitatorisissa synapseissa ja sitoutuvat presynaptisiin reseptoreihin kuten neureksiineihin ja proteiini tyrosiini fosfataaseihin (PTP) muodostaen hermosoluliitoksen ja edistäen presynaptista erillaistumista. Synaptisten adheesioproteiinien toiminnan häiriöt liittyvät geneettisesti kogntiivisiin häiriöihin, kuten esimerkiksi autismikirjon häiriöihin ja skitsofreniaan. Tässä tutkimuksessa on tutkittu SALM-perheen adheesionproteiinien molekyylirakenteita sekä niiden toimintaa solu- ja proteiinsitoutumiskokeiden avulla, ja eritysesti karakterisoitu SALM-proteiinien sitoutumista presynaptiseen PTP-delta proteiiniin. Lisäksi väitöstyössä on kehitetty inhibiittoriseulontamenetelmä synapsin adheesiointeraktioille, erityisesti kemiallisten yhdisteiden löytämiseksi LRRTM2-neureksiini vuorovaikutuksen inhiboimiseksi bioteknologisia sovelluksia varten. SALM proteiineja on karakterisoitu viisi (SALM1-5). Tässä tutkimuksessa on määritetty SALM3 ja SALM5 proteiinien solunulkoisten domeenien molekyylikiderakenteet 3.1 Å ja 2.8 Å resoluutiolla. Keskeinen havainto on LRR domeenien tärkeä rooli proteiinien järjestäytymisessä funktionaalisiksi dimeereiksi, tutkimuksessa on myös määritetty affiniteetit SALM3-PTP ja SALM5-PTP vuorovaikutuksilla. Lisäksi pienkulma röntgensirontamenetelmällä määritettiin SALM3-PTPdelta kompleksin rakenne ja selvitettiin domeeniorganisaatio ja reseptorikompleksin stoikiometria. Kaikkiaan SALM3 sitoutuu PTP reseptoreihin samoin kuin aiemmin on todettu SALM5:lle ja ilmeisesti SALM-proteiinit näin ollen toimivat samalla mekanismilla soluadheesiossa. Erityisesti ne kaikki muodostavat samanlaisia dimeerirakenteita, joka poikkeavat muista synaptisista ahdeesiomolekyyleistä, jotka yleensä ovat monomeerisia. Tällä todennäköisesti on funktionaalista merkitystä synapsien signaalinvälityksessä. Kaikkiaan tehty tutkimus ovat antanut laajemman käsityksen SALM ja PTP adheesioproteiinien toiminnasta. LRRTM2-neureksiini vuorovaikutuksen inhibitiomenetelmän kehitys luo pohjaa tuleville pienmolekyyliseulontatutkimuksille neureksiiniligandeja vastaan, mahdollistaen kemiallisen intervention in vivo tutkimuksissa esimerkiksi hiirimalleissa, ja mahdollisesti avaten uusia reittejä neurologisten häiriöiden lääkekehitykseen.
Subject: biochemistry and structural biology
Rights: This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
karki_sudeep_dissertation_2020.pdf 10.68Mb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record