Reptarenaviruses in constrictor snakes : tissue tropism and immune responses

Abstract

The family Arenaviridae is a well-represented clade of RNA viruses. The genus Mammarenavirus is dominated by rodent-borne arenaviruses, several of which have been identified as the causative agents behind hemorrhagic fevers and neurological infections in humans. Despite having been studied for more than 90 years, mammarenavirus diagnostics, vaccines and antiviral compounds are only available for some mammarenaviruses. Another genus, Reptarenavirus, includes viruses linked to boid inclusion body disease (BIBD) in constrictor snakes. BIBD has been reported in captive constrictor snake species since the 1970s, but the etiological agents were only identified in 2012. BIBD can lead to the eradication of the entire affected snake populations. The range of possible host spectrum and the immune response against reptarenaviruses are not well characterized. This thesis aims to define the potential reptarenavirus host cell spectrum as well as expand understanding of the boid immune response.

One of the hallmark signs of reptarenavirus infection in snakes is the formation of inclusion bodies (IB) in host cells. Snakes are poikilotherm and the replication of viruses is often susceptible to temperature variation. Reptarenavirus infection in mammalian, boid, and arthropod cells, incubated at 37 °C did not induce IB formation, whereas prominent IB formation occurred in all three phyla when incubated at 30°C. Reptarenaviruses replicated efficiently at 30°C, whereas at 37°C the replication efficiency reduced significantly. Many animal viruses take advantage of glycoproteins (GPs) to mediate binding and entry via attachment to host cell surface receptors. To study the ability of reptarenavirus GPs to mediate cell entry, a pseudovirus system based on reporter gene-bearing recombinant vesicular stomatitis virus (rVSV) was introduced. The pseudoviruses with reptarenavirus GPs served to demonstrate that the majority of arenavirus GPs could mediate entry to both mammalian and reptilian cells but at varying efficiencies.

In order to validate the link between BIBD and reptarenavirus infection, constrictor snakes (Boa constrictor and Python regius) were experimentally infected. Despite transient central nervous system signs, IB were not detected in the infected snakes. The snakes were sacrificed and sera was collected to determine the magnitude of the humoral immune response. In order to assess the antibody response against reptarenaviruses it was necessary to develop reagents capable of detecting immunoglobulins in snake sera. The generated reagents were initially tested using sera from BIBD-positive snakes. IgY and IgM class antibodies binding reptarenaviruses were detected in serum samples, validating the functionality of the reagents. In the next study, these antibodies were used to detect IgM and IgY antibodies in experimentally and naturally infected snake populations. Extracted sera was further assayed using the rVSV-based pseudoviruses decorated with reptarenavirus GPs to show a neutralizing antibody response following reptarenavirus infection.

This thesis adds to understanding of reptarenavirus infectivity across species barriers. The generation of novel diagnostic reagents will allow generation of serodiagnostic tools for reptarenavirus infection. Future studies of reptarenaviruses should aim to establish a virus-specific link between reptarenaviruses and BIBD that could serve in the development of effective and preventive treatment strategies.

RNA-virukset, Arenaviridae-heimo mukaan lukien, muodostavat laajan ja monimuotoisen mikrobijoukon. Mammarenavirus- suvun virukset ovat pääosin jyrsijöiden viruksia, joista eräät ihmiseen tarttuessaan voivat aiheuttaa verenvuotokuumeita, toiset keskushermostotulehduksia. Vaikka mammarenaviruksia on tutkittu yli 90 vuoden ajan, diagnostiikkaa, rokotteita ja viruslääkkeitä on kehitetty vain joitain mammarenaviruslajeja vastaan. Toinen suku, Reptarenavirus, koostuu kuristajakäärmeiden viruksista, jotka on yhdistetty tautiin nimeltä Boid Inclusion Body Disease (eng.), BIBD. BIBD:tä esiintyy vankeudessa elävillä kuristajakäärmeillä ja sitä on havaittu 1970-luvulta lähtien, mutta taudinaiheuttajat tunnistettiin vasta vuonna 2012. BIBD on vaarallinen sairaus käärmeille ja se voi johtaa koko käärmekokoelman hävittämiseen. Reptarenavirusten isäntälajikirjo ja immuunivasteen kehittymisen mekanismeja tartunnan saaneilla eläimillä ei toistaiseksi tunneta yksityiskotaisesti. Tämän työn tavoitteisiin kuului reptarenaviruksen isäntäsoluspektrin tunnistaminen sekä käärmeidein immuunivasteen tutkimus.

Reptarenavirukset aiheuttavat infekoituneissa soluissa inkluusiokappaleiden (IB, inclusion body, eng.) muodostumista. Aiempien raporttien mukaan IB:eiden muodostus on tyypillinen löydös tutkittaessa infektoituneita käärmeitä. Nisäkässoluille luonnollisessa 37°C:een lämpötilassa reptarenavirusinfektoituneissa soluissa ei havaittu selkeää IB:ien muodostusta, vastaavasti käärmesolujen viljelylämpötilassa (30°C) havaittiin voimakasta IB:ien muodostusta eri niveljalkais- ja nisäkässolulinjoissa. Virusten kykyä replikoitua testattiin niveljalkais-, nisäkäs- ja matelijasolulinjoilla kahdessa lämpötilassa, 30°C ja 37°C. Virukset replikoituivat tehokkaasti 30°C:een lämpötilassa, mutta heikosti 37°C:een lämpötilassa.

Monet vaipalliset virukset hyödyntävät glykoproteiineja (GP) isäntäsolupinnan reseptoreihin sitoutumiseen sekä isäntäsolun ja viruskalvon välisen fuusion. Reptarenaviruksien GP:ien kykyä kuljettaa virus erilaisiin solutyyppeihin käytettiin geneettisesti muokattua vesikulaarista stomatiitti-virusta (rVSV, recombinant vesicular stomatitis virus, eng.), jonka pintarakenne korvattiin eri arenaviruksien GP:eilla. Kokeissa havaittiin eri arenaviruksien GP:ien kykenevän kuljettamaan reportterigeenillä varustetun pseudoviruksen useisiin eri kudoksista peräisin oleviin matelija- että nisäkässoluihin vaihtelevalla tehokkuudella.

Kokeellista reptarenavirusinfektiota kuristajakäärmeillä (Boa constrictor ja Python regius) käytettiin työkaluna BIBD:n ja reptarenavirusinfektion välisen yhteyden todistamiseksi. Reptarenavirusinfektoiduilla eläimillä havaittiin ohimeneviä keskushermosto-oireita, mutta BIBD:een liittyvää IB:ien muodostumista ei havaittu koe-eläimillä. Käärmeet tapettiin ja kerätyistä seeruminäytteistä tutkittiin reptarenaviruksia vastaan kehittynyttä humoraalista immuunivastetta. Reptarenavirusten immuunivasteen arvioimiseksi oli välttämätöntä kehittää reagensseja, jotka kykenevät havaitsemaan immunoglobuliinit käärmeseerumista. Kehitettyjen reagenssien toimivuutta arvioitiin ensin BIBD:iä sairastavien käärmeiden seerumeilla. Seeruminäytteissä havaittiin reptarenavirusta tunnistavia IgY- ja IgM-luokan vasta-aineita, ja tämän avulla kyettiin osoittamaan luotujen reagenssien toimivan halutulla tavalla. Seuraavassa tutkimuksessa käärmeiltä löydettiin reptarenaviruksia tunnistavia IgY- ja IgM-luokan vasta-aineita sekä kokeellisen että luonnollisen reptarenavirusinfektion seurauksena. Reptarenaviruksien GP:eilla koristeltuja rVSV pseudoviruksia hyödynnettiin reptarenavirusinfektiota neutraloivien vasta-aineiden etsimiseen käärmeiden seerumista. Sekä kokeellisen että luonnollisen reptarenavirusinfektion seurauksena käärmeille oli kehittynyt reptarenavirusinfektiota neutraloivia vasta-aineita.

Tämän väitöskirjan töiden ansiosta tunnemme paremmin reptarenaviruksen kykyä hyppiä lajirajojen yli. Työssä kehitettyjen uusien reagenssien avulla voidaan jatkossa kehittää testejä reptarenavirusinfektion havaitsemiseen eläviltä käärmeiltä. Tulevaisuuden tavoitteisiin reptarenavirologian alalla kuuluu muun muassa eri reptarenaviruslajien ja BIBD:n yhteyden tutkiminen, joka puolestaan voi auttaa kehittämään tehokkaita hoitoja tai menetelmiä infektioiden ennaltaehkäisyyn.