Surface Plasmon Resonance-Based Cellular Assays in Pharmaceutical Research : Interpretation of the Label-Free Signals

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-51-6890-0
Title: Surface Plasmon Resonance-Based Cellular Assays in Pharmaceutical Research : Interpretation of the Label-Free Signals
Author: Suutari, Teemu
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Pharmacy, Division of Pharmaceutical Biosciences
Doctoral Programme in Materials Research and Nanoscience
Publisher: Helsingin yliopisto
Date: 2020-12-18
Language: en
Belongs to series: Doctoral School in Natural Sciences Dissertation Series, University of Helsinki - URN:ISSN:2670-2010
URI: http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-51-6890-0
http://hdl.handle.net/10138/322101
Thesis level: Doctoral dissertation (article-based)
Abstract: Cell-based assays have become an integral part of pharmaceutical research and drug development. They offer researchers not only a means to investigate basic cellular functions and different disease states, but also a way to study drug action in cells. Nowadays, during the long journey that new drug candidates take from an early discovery to a final product, all drug candidates undergo a preclinical test phase where their properties are evaluated using various cell-based assays. While perhaps the most common and important goal for these cell-based assays is to ensure that the investigated molecules are not harmful to cells, cell-based assays are also used to investigate the biological activity, mechanisms of action, and possible interactions, such as interaction with other drugs. With the traditionally used cell-based assays it is a common practice to alter the investigated pharmaceuticals or cells, or both, to produce a measurable signal, such as radioactivity, chemiluminescence, or fluorescence. However, there are well-known issues with this strategy, not the least that by subjecting the pharmaceuticals and/or cells to these modifications, an artificial system is created where the cells or pharmaceuticals under investigation are no longer in their original state. This can have a profound impact on the properties of the pharmaceuticals or behavior of the cells, thereby resulting in erroneous readouts. Because of this, different label-free cell-based assays are an attractive and logical alternative. Label-free technologies have been applied in the field of drug research and discovery since the 1980s. During the turn of the last millennium an increasing number of studies have implemented these methods to measure cellular activity, such as receptor activation. Nowadays, some of the commercial label-free devices are designed specifically with cell-based assays in mind. Of course, these technologies are not without their own challenges. The most prominent of these stems from the inherit property of these technologies: they are not sensitive to just a single predefined cellular event or response, but instead they measure cell activity as a whole. While well-controlled experimental design can mitigate the contribution of non-relevant cell responses to the measured label-free signals, advanced signal analysis methods have made, and can be expected to continue to make, label-free cell-based assays even more powerful tools for cell studies and help researchers to better understand the effect of different cellular activities on the label-free signals. Amongst the different label-free techniques, optical methods have been widely adopted for cell-based assays. While resonant waveguide grating (RWG) has been mainly utilized in the investigation of membrane receptors, namely G protein-coupled receptors (GPCRs) and receptor tyrosine kinases (RTKs), surface plasmon resonance (SPR) has been applied in the study of a variety of cellular processes, such as cell adhesion, detachment, spreading, contraction, cytoskeleton rearrangement, cell-to-cell contacts, monolayer formation and cell death. Surprisingly, studies on GPCRs with SPR are relatively low in number, even though they should be of high interest as around 35% of all current drugs mediate their effect via these receptors. Although SPR has already been shown to be a powerful tool for studying various cellular processes, its wider use in life sciences is hampered by the challenge in interpreting the contribution of the cell responses of interest and other non-relevant responses interfering with the measured signals. A variety of NPs are used as drug carriers, especially for biological drugs, in order to protect them from degradation and guide them to diseased cells or other desired location within the human body, while EVs are naturally produced nanosized structures that function as message carriers between cells. Because of the inherent property of EVs to penetrate cellular barriers, there is a growing interest in using them as “natural” and personalized drug carriers. This thesis investigates the use of SPR in the context of cellular uptake studies of nanoparticles (NPs) and extracellular vesicles (EVs), and GPCR-mediated signaling. Various approaches to analyze real-time label-free SPR signals are implemented in order to improve the correlation between the measured SPR responses and cell activities. The results show, for the first time, how SPR can be used to measure cellular uptake of NPs and EVs. However, because NP and EV uptake lead to ambiguous SPR signals, different signal analysis strategies are investigated and implemented to provide meaningful SPR responses. Three strategies proved to be effective: (1) varying the measurement temperature allowed to investigate possible cell entry mechanisms of different NPs in HeLa cells; (2) correcting the SPR angle response by removing the contribution of total internal reflection (TIR) angle shift allowed the quantification of the uptake efficacy of functionalized NPs into HT-29 colorectal adenocarcinoma cells; (3) comparing the responses measured with two different wavelengths corrected for the large response variation observed across different experiments for EV uptake in PC-3 prostate cancer cells. In addition, multiple label-free SPR parameters from the full SPR curves were analyzed after stimulating different GPCR subtypes, signaling primarily via Gs-, Gq- or Gi-coupled pathways. It was revealed that by combining two key label-free parameters, unique label-free signal profiles for each pathway could be generated, which makes it possible to recognize the pathway coupling of the receptor subtypes from the label-free responses alone, which has not been possible before. Collectively, these results demonstrate how SPR can be effectively utilized in cell-based assays to investigate NP and EV uptake and cell signaling. Cell-based SPR provides high information content, and with the help of the developed and used analysis methods, the otherwise hard-to-interpret label-free signals provide meaningful information on these cell responses.Soluja on kasvatettu laboratorio-oloissa jo yli puoli vuosisataa solutoimintojen ja lääkkeiden vaikutusmekanismien tutkimiseksi. Nykyään eri tutkimusmenetelmiä on runsaasti ja elävillä soluilla tehtävät kokeet ovat keskeinen osa farmaseuttista tutkimusta ja lääkekehitystä. On kuitenkin hyvin tavallista, että lääkkeiden vaikutuksia tutkittaessa soluja tai lääkeaineita joudutaan muokkaamaan eri tavoin. Solut voidaan esimerkiksi muuntaa tuottamaan tiettyä merkkiproteiinia tai tutkittavaan lääkeaineeseen voidaan lisätä fluoresoiva molekyyli. Nämä muokkaukset ovat tarpeellisia, koska käytetyt mittalaitteet perustuvat näiden merkkimolekyylien havainnointiin. Tämä lähestymistapa voi kuitenkin olla ongelmallinen, koska muokkaukset voivat vaikuttaa siihen, miten solut tai tutkittavat lääkkeet käyttäytyvät. Tämä voi puolestaan johtaa tulosten virheellisiin tulkintoihin. Leimavapaita mittatekniikoita on käytetty lääketutkimuksessa jo pitkään, ja vuosituhannen vaihteen jälkeen niiden käyttö elävien solujen tutkimuksessa alkoi yleistyä. Optiseen havainnointiin perustuvat reaaliaikaiset leimavapaat tekniikat, kuten pintaplasmoniresonanssi (surface plasmon resonance, SPR), tarjoavat selviä etuja verrattuna perinteisiin yleisesti käytössä oleviin solututkimusmenetelmiin. Nimensä mukaisesti ne mittaavat soluja reaaliajassa, mutta merkittävintä on niiden kyky mitata soluvasteita ilman leima-aineita. Toisin kuin leima-aineisiin perustuvat menetelmät, optinen leimavapaa havainnointi on herkkä monille eri solumuutoksille. Näin myös ennalta odottamattomat soluvasteet voidaan havainnoida. Toisaalta näiden epäspesifisten optisten signaalien tulkinta on haastavaa. Tässä väitöskirjassa tutkittiin, kuinka SPR-tekniikkaa voidaan hyödyntää solumittauksissa. Vaikka vastaavilla menetelmillä on jo aikaisemmin tutkittu runsaasti muun muassa reseptoreiden toimintaa, leimavapailla menetelmillä ei ole tutkittu nanopartikkelien soluun ottoa. Soluun oton tutkiminen on tärkeää, koska nanopartikkelit ovat nousseet merkittävään rooliin modernissa lääketutkimuksessa ja kehityksessä. Tämä johtuu siitä, että yhä suurempi osa uusista kehitteillä olevista lääkkeistä on suuria molekyylejä, kuten proteiineja tai DNA- tai RNA-pohjaisia lääkeaineita. Rakenteensa takia ne eivät kulkeudu passiivisesti solujen sisään, joten ne on pakattava erilaisiin nanopartikkeleista valmistettuihin lääkekuljettimiin. Synteettisten nanopartikkelien lisäksi työssä tutkittiin solun ulkoisten vesikkelien soluun ottoa. Näistä vesikkeleistä on povattu uudentyyppisiä lääkekuljettimia, koska niillä on kyky läpäistä solukalvo ja solujen luonnollisesti erittäminä rakenteina ne eivät aiheuta puolustusreaktiota elimistössä. Työn keskeisenä osana oli lisäksi leimavapaiden signaalien tulkinta. Koska solujen tuottamat SPR-signaalivasteet ovat moninaisia ja epäspesifisiä, työssä tutkittiin erilaisten signaalianalyysimenetelmien kykyä tuottaa oleellista tietoa soluvasteista. Tulokset osoittivat, että oikeanlaisella analyysillä saadaan tietoa eri nanopartikkelien ja solun ulkoisten vesikkelien soluun oton tehokkuudesta, ja myös mahdollisesti niiden soluun oton mekanismeista. Lisäksi soluista tai näytteistä johtuvaa signaalivaihtelua kyettiin korjaamaan tulosten vertailun mahdollistamiseksi. Osaltaan nämä tulokset saavutettiin käyttämällä SPR-laitetta, joka kykenee mittaamaan useampaa leimavapaata parametria samanaikaisesti. Tätä SPR-laitteen ominaisuutta hyödynnettiin myös G-proteiinikytkentäisten reseptorien aktivaation tulkitsemisessa. Tulokset osoittivat, että tarkastelemalla useampaa kuin yhtä parametria samanaikaisesti, G-proteiinikytkentäiset reseptorit voidaan tunnistaa niiden G-proteiininalatyypin mukaan. Tässä ei ole onnistuttu yhtä luotettavasti aiemmin edes muilla leimavapailla menetelmillä.
Subject: biofarmasia
Rights: This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
suutari_teemu_dissertation_2020.pdf 21.78Mb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record