Geenin usp45 hiljennys Lactococcus lactis -maitohappobakteerissa ja hiljennyksen vaikutus proteiinien eritykseen

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-202012104971
Title: Geenin usp45 hiljennys Lactococcus lactis -maitohappobakteerissa ja hiljennyksen vaikutus proteiinien eritykseen
Author: Juuti, Noora
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Agriculture and Forestry, Department of Food and Nutrition
Publisher: Helsingin yliopisto
Date: 2020
Language: fin
URI: http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-202012104971
http://hdl.handle.net/10138/322737
Thesis level: master's thesis
Discipline: Mikrobiologia
Microbiology
Mikrobiologi
Abstract: Usp45 on Lactococcus lactis -maitohappobakteerien runsain Sec-reitin kautta erittyvä proteiini, jonka 27 aminohapon mittaista signaalipeptidiä (SPUsp45) käytetään yleisesti vierasproteiinien erityksen tehostamisessa. L. lactis -kantojen merkitys on yhä enenevissä määrin laajentunut elintarvikkeiden valmistuksesta geenitekniikkaan, ja siitä onkin tullut Bacillus subtilis -bakteerin ohella yksi Gram-positiivisista genetiikan malliorganismeista. SPUsp45:n laajasta käytöstä ja tutkimuksesta huolimatta Usp45-proteiinin biologisesta merkityksestä sitä tuottaville soluille tiedetään kuitenkin vain vähän. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli tutkia, voiko L. lactis NZ9000 -bakteerikannan tuottamien vierasproteiinien saantoa parantaa, kun sen luonnollisesti suurina määrinä erittyvän Usp45-proteiinin eritystä vähennetään. Hypoteesina oli, että Usp45:n runsas erittyminen toimii Sec-erityskoneiston pullonkaulana, ja sen vähentäminen vapauttaa koneiston kapasiteettia vierasproteiineille. Hypoteesin taustalla oli oletus, että Usp45 ei ole L. lactis -bakteerille elintärkeä. Tutkimusta varten rakennettiin L. lactis NZ9000 -kannasta johdettu klooni LAC455, jossa on nisiinillä indusoitavan antisense-usp45-geenin (ASusp45) sisältävä pLEB805-plasmidi. Antisense-RNA-tekniikkaan perustuvan hiljennyksen avulla seurattiin Usp45-proteiinin vaikutusta solujen kasvuun ja morfologiaan sekä erittyvien proteiinien kokonaismäärään ja laatuun. Vierasproteiinien erittymistä usp45-hiljennetyissä soluissa seurattiin bakteriosiinien leukosiini A ja C avulla, jotka tuotiin soluihin ekspressiovektoreissa. Tutkimuksen perusteella Usp45:n hiljentäminen näkyy selvästi solujen kasvukyvyn heikkenemisenä, soluseinän muutoksina, solujen jakautumisen ja normaalin ketjuuntumisen häiriintymisenä, solujen yhteen takertumisena sekä solun sisäisten proteiinien vuotamisena ulos soluista. Tulosten perusteella Usp45:n toiminta on välttämätön L. lactis -soluille, eikä sen tuoton vähentäminen paranna heterologisten proteiinien erittämistä.Usp45 is the major secreted protein in Lactococcus lactis. Protein’s 27-aa signal peptide (SPUsp45) is widely used for increased secretion and improved yields of heterologous proteins. L. lactis, previously used mainly in food production, has gained increasing popularity in gene technology and, thanks to extensive research, became a Gram-positive model organism alongside Bacillus subtilis. Despite the widespread use of its signal peptide, the biological role of Usp45 protein remains largely a mystery. The aim of this study was to test whether decreased translation of the naturally highly secreted Usp45 protein would lead to improved secretion of desired heterologous proteins. The hypothesis was that high levels of secreted Usp45 cause the Sec translocon becoming a bottleneck and by reducing this strain on the secretion route, the capacity to secrete other proteins could increase. Based on literature, usp45 is not part of the L. lactis core genome and was assumed to be non-vital. To study this, the L. lactis strain NZ9000 was transformed with the plasmid pLEB805 which contains a nisin inducible antisense-usp45 gene (ASusp45) resulting in strain LAC455. The effect of antisense-RNA mediated silencing on growth and morphology of the cells was observed as well as the changes in quantity and quality of secreted proteins in ASusp45 induced cells. The secretion of heterologous proteins was tested with bacteriocins leucocin A and C that were introduced to the cells in expression vectors. This study brought new information on the function of the usp45 gene in L. lactis. The results show that the silencing of the usp45 gene leads to retarded growth rate, multifold ingrowth of the cell wall, aggregation of the cells and the leakage of cytoplasmic proteins leading to loss of viability of the cells. These results demonstrate that Usp45 is vital for the structure of the cell wall, cell separation and normal chain formation, and it probably acts as a vital peptidoglycan hydrolase.
Subject: Lactococcus lactis
proteiinien eritys
Usp45
solumorfologia
vierasproteiinien tuotto


Files in this item

Files Size Format View

There are no files associated with this item.

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record