DicerHET primary neuronal culture model for studying role of miRNA biogenesis pathway in Parkinson’s disease

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-202012104913
Title: DicerHET primary neuronal culture model for studying role of miRNA biogenesis pathway in Parkinson’s disease
Author: Soleimanbeigi, Shirin
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Agriculture and Forestry, Department of Agricultural Sciences
Publisher: Helsingin yliopisto
Date: 2020
Language: eng
URI: http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-202012104913
http://hdl.handle.net/10138/322747
Thesis level: master's thesis
Discipline: Biotekniikka (MAAT)
Biotechnology (MAAT)
Bioteknik (MAAT)
Abstract: Tiettyjen hermosoluryhmien vajaatoiminta ja rappeutuminen on ikään liittyville hermoston rappeumasairauksille yhteinen ilmentymä. Parkinsonin tauti (PD) on yleinen etenevä hermoston rappeumasairaus, jonka oireet pahenevat taudin edetessä. Tautia luonnehtii dopamiinia (DA) tuottavien hermosolujen asteittainen rappeutuminen sekä merkittävät proteiinikertymälöydökset, ns. Lewyn kappaleet (Lewy body; LB), jotka koostuvat lähinnä presynaptisesta proteiinista nimeltä α-synukleiini (αSyn). PD:n hoitoratkaisut painottuvat edelleen oireiden lievitykseen, sillä hermorappeumaa käynnistäviä tautimekanismeja ei vielä täysin ymmärretä. Kahden edellisen vuosikymmenen aikana mikroRNA (miRNA)-molekyylit ovat herättäneet suurta kiinnostusta eri biolääketieteen aloilla ja saaneet erityistä huomiota hermorappeumasairauksien tutkimuksessa. Viimeisimmät kehitykset viittaavat siihen, että miRNA-tasot muuttuvat sekä ikääntymiskudoksessa että monien ikään liittyvien sairauksien yhteydessä, kuten PD:ssä. Tuoreissa tutkimuksissa on myös havaittu, että Dicer:in, miRNA-molekyylien synteesireitin tärkeimmän entsyymin, ilmentyminen alentuu ikääntymisen myötä. Tätä mekanismia on pyritty jäljittelemään DicerHET hiirimallilla, joka perustuu Dicer-geenin heterotsygoottiseen mutageneesiin. Alustavissa tutkimuksissa DicerHET-malli osoittautui lupaavaksi tutkimusmalliksi häiriintyneen miRNA-synteesireitin ja PD:hen liittyvän hermorappeuman välisen yhteyden tutkimiseen. Täten, tulevien tutkimustöiden helpottamiseksi ja lääkeaineseulontojen nopeuttamiseksi, tässä työssä olemme pyrkineet tuottamaan vastaavaa DicerHET in vitro mallia soveltamalla kätevää perimänmuokkauksen menetelmää. Tavoitteena oli kelpuuttaa malli ja luoda yhdenmukainen ja toistettava menetelmä tuleviin töihin, joissa tutkitaan miRNA-biosynteesin roolia PD:n tautimekanismissa. DicerHET-genotyyppi tuotettiin soluviljelmissä, yhdistämällä perinteistä Cre/loxP-systeemiä viruksen välittämään Cre-synteesiin. Tarkemmin ottaen, aivokuoren primääriviljelmät, jotka olivat peräisin Dicer flox/+ -hiirien alkioista, transdusoitiin Cre:tä ilmentävillä lentivirusvektoreilla (lenti-hSYN-T2A-Cre) "loxp-rajatun" Dicer-alleelin poistamiseksi. Määrittääksemme menetelmälle optimaaliset parametrit, arvioimme rekombinaatiotehokkuutta eri transduktio-olosuhteissa. Optimaalisissa olosuhteissa pystyimme saavuttamaan tehokkaan rekombinaation 5 päivän induktion jälkeen viljelmissä. Immunohistokemialliset värjäykset osoittivat kuitenkin, että DicerHET -genotyyppi ei heikentänyt solujen eloonjäämistä. Havainnollistaaksemme tutkimusmallin konseptia, altistimme DicerHET-viljelmät vielä ns. ennalta muodostetuille fibrilleille (pre-formed fibrils; PFF) – tämä on PD:een liittyvä stressitekijä, joka saa αSyn-proteiinit kertymään rykelmiin. pSer129-αSyn-positiivisia LB:n kaltaisia rykelmiä havaittiin kaikissa PFF-käsitellyissä viljelmissä. Rykelmiä kertyi kuitenkin enemmän DicerHET-viljelmiin. Tämä ei kuitenkaan aiheuttanut lisääntynyttä solukuolemaa, mikä viittaa siihen, että DicerHET -genotyyppi ei lisää aivokuoren neuronien haavoittuvuutta pSer129-αSyn-kertymiä kohtaan. Aikaisempien tutkimuksiemme perusteella oletamme, että DA-hermosolut ovat erityisen herkkiä ikääntymiseen liittyvää Dicer-entsyymitason alentumista kohtaan. Tästä kiehtovasta yhteydestä olisi mahdollista saada lisänäyttöä tulevissa tutkimuksissa soveltamalla DicerHET- mallia yhtä helposti primäärisiin DA-neuroneihin.Selective degeneration and dysregulation of specific neuronal populations is a common hallmark shared by neurodegenerative diseases affecting the aging population. Parkinson’s disease (PD) is one of the most prevalent neurodegenerative diseases with debilitating clinical manifestations that follow a chronic and progressive course. Pathological hallmarks of PD involve gradual and specific loss of DA (DA) neurons and widespread presence of Lewy body (LB) inclusions that consist of aggregated presynaptic protein, α-Synuclein (αSyn). Treatment of PD remains to be at symptomatic management as the underlying mechanisms that trigger neurodegeneration are still not fully elucidated. Over the past two decades, microRNAs (miRNAs) have become a major area of interest within biomedical fields and gained increasing momentum in the context of neurodegenerative diseases. In recent developments, changes in mature miRNA profiles have been reported in aging tissue and many age-related diseases, including PD. More recently, a number of studies have found that the most essential enzyme in the miRNA biogenesis pathway, Dicer, exhibits reduced expression with aging. To these ends, a genetic mouse model based on heterozygous knockout of Dicer (DicerHET) was introduced to simulate Dicer downregulation. Initial investigations identified the DicerHET model as a promising tool for studying the relationship between disrupted miRNA biogenesis and neurodegeneration associated with PD. To facilitate future investigations and speed up screening of potential therapeutic compounds using this genetic model, in the current work, we aimed to produce a DicerHET in vitro model with a practical and convenient genetic engineering approach. The main focus of this work was to validate the model and establish a standardized reproducible approach suitable for research that addresses the role of miRNA biogenesis in PD. The desired DicerHET genotype was generated in vitro by employing traditional Cre/loxP system in conjunction with a virally mediated Cre expression. More specifically, primary cortical cultures, derived from Dicer flox/+ mice embryos, were transduced with Cre expressing lentiviral vectors (lenti-hSYN-T2A-Cre) to delete the “floxed” Dicer allele. To establish optimal parameters for the procedure, we analysed recombination efficiency under different transduction conditions. The most efficient recombination was achieved after 5 days of induction in cultures. However, we observed that DicerHET genotype did not attenuate survival of the cells, as assessed by immunohistochemistry. Further, as a proof of concept, we exposed the DicerHET cultures to pre-formed fibrils (PFFs) - a PD related stressor that causes αSyn aggregation. pSer129-αSyn-positive LB-like aggregates were detected in all the PFF-treated cultures, however, with a greater accumulation in the DicerHET cultures. Interestingly, increased aggregation was not accompanied by increased cell death, suggesting that DicerHET genotype does not increase vulnerability of cortical neurons to pSer129-αSyn aggregation. Based on our earlier studies we presume that DA neurons may bear a specific vulnerability towards the age-related Dicer depletion. More conclusive evidence on this intriguing relationship could be provided in future research using the DicerHET model that can be readily applied to primary DA cultures.
Subject: microRNA
Parkinson’s disease
Cre/loxP
lentiviral vectors
preformed fibrils
PFF
Lewy body
mikroRNA
Parkinsonin tauti
lentivirusvektori
ennalta muodostetut fibrillit
Lewyn kappale


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
Soleimanbeigi_Shirin_ProGradu_2020.pdf 1.376Mb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record