Characterization of MHC-I restricted immunogenic peptides by immunological and in silico methods

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-202012235481
Title: Characterization of MHC-I restricted immunogenic peptides by immunological and in silico methods
Author: Mäki, Toni
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Pharmacy
Publisher: Helsingin yliopisto
Date: 2020
Language: eng
URI: http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-202012235481
http://hdl.handle.net/10138/323636
Thesis level: master's thesis
Discipline: Biofarmasia
Biopharmaceutics
Biofarmaci
Abstract: Ihmisen immuunijärjestelmä on osoittautunut merkittäväksi tekijäksi kehitettäessä uusia hoitomuotoja erilaisten syöpäsairauksien hoidossa. Vaikka ajatus immuunijärjestelmän aktiivisesta toiminnasta mutatoituneiden syöpäsolujen tunnistamisessa ja hävittämisessä onkin jo yli vuosisadan ikäinen, ovat vasta viimeaikaiset edistysaskeleet useilla aloilla, kuten massaspektrometriassa, T-soluvälitteistä immuunivastetta voimistavissa hoidoissa sekä in silico -mallinnusmenetelmissä, mahdollistaneet immuunijärjestelmän kokonaisvaltaisen hyödyntämisen potentiaalin kartoittamisen syöpähoidoissa sekä yksilöllisten hoitomuotojen kehityksessä. Näihin immuterapiamuotoihin kuuluvat muun muassa onkolyyttiset virusterapiat, T-soluvälitteiset hoidot sekä syöpärokotteet. Näiden immunoterapiamuotojen vaikutusmekanismi perustuu elimistön kykyyn tunnistaa mutatoituneiden syöpäsolujen pinnalla esiintyviin MHC-reseptoreihin (tunnetaan ihmisissä nimellä HLA-reseptori) sitoutuneita immuunivasteen herättäviä peptidiantigeenejä, sekä ko. solujen hävittämiseen sytotoksisten T-solujen toimesta. Tästä syystä menetelmät jotka mahdollistavat yksilöllisen HLA-peptidomin tutkimisen sekä immunogeenisten peptidien tunnistamisen tarjoavat perustan immunoterapioiden kirjolle ja ovat jatkuvan tutkimuksen polttopisteessä. Tämä Pro gradu -tutkielma on osa projektia, jonka tavoitteena on kehittää immunoaffiniteettipuhdistukseen ja nestekromatografia/massaspektrometriaan perustuva menetelmä MHC-ligandien analysoimiseksi ja T-soluvasteen herättävien syöpäantigeenien määrittämiseksi syöpäsoluista. Työn tavoitteet olivat: 1. Syopäsolulinjojen karakterisointi 2. Immunologisten kokeiden testaaminen 3. Solumateriaalin kasvatus immunoaffiniteettipuhdistusta varten 4. Valikoitujen peptidiligandien immunogeenisyyden arviointi in silico -menetelmillä Käytetyt menetelmät: 1. Solulinjojen kasvatus 2. FACS-analyysi 3. MTS-viebiliteettikokeet 4. Immunologiset kokeet (ELISA, ELISPOT) 5. Immunologisten bioinformatiikka-analyysityökalujen käyttö (IEDB) sekä tietokantahakujen tekeminen (UniPROT) Tulokset: 1. Virtaussytometria-analyysi (FACS) tarjosi olennaista tietoa tutkittujen solulinjojen HLA-I -ekspressiosta. Ohessa kerätty tieto solujen PD-1 -ligandiekspressiosta voidaan hyödyntää arvioidessa syöpäsolujen kykyä suojautua immuunijärjestelmää vastaan. Alustavia MTS-kokeita käytettiin arvioimaan soveltuvat olosuhteet ja tulosten lineaarisuus jatkotutkimuksia varten. 2. T-solujen interferoni-γ -eritystä tutkittiin ELISPOT-menetelmällä, käyttäen tunnettuja antigeenejä ja koetta käytettiin jatkotutkimusten kehittämiseen. ELISA-menetelmällä varmistettiin HLA-reseptorien läsnäolo immunoaffiniteettipuhdistukseen käytetyistä näytteistä, sekä arvioitiin puhdistusmenetelmän toimivuutta. 3. Tutkittiin in silico -menetelmien käyttökelpoisuutta immunogeenisten peptidien tunnistamisessa. Kokeilla saatiin kerättyä tietoa, jota pystyttiin hyödyntämään projektin ja menetelmien jatkokehityksessä. In silico -menetelmillä määritettiin syöpäsoluista joukko entuudestaan tunnettuja MHC-reseptoriin sitoutuvia peptidejä, sekä 1 entuudestaan tunnettu T-soluvasteen herättävä peptidi. Vaikka määritetyt peptidit olivatkin vain nimellisesti validoituja, tulokset rohkaisevat kehittämään menetelmää eteenpäin.The human immune system can provide a powerful tool in developing therapies against various cancers. Even though the idea of an immune system actively searching for and disposing of potential mutated tumor cells is over a century old, only recent developments in various fields such as mass spectrometry, immuno-checkpoint blockade strategies and in silico modelling have enabled the realization of the full potential of recruiting immune system to fight cancer and the possibilities of personalized therapies. These therapeutic methods, including but not limited to oncolytic virus therapies, T-cell therapies and cancer vaccines, are based on the body’s ability to recognize mutated antigen peptides presented on the cell surface by MCH-receptors (also known as HLA-receptors in humans) and the disposal of the malignant cells by cytotoxic T-cells. Thus, the capability to map the individual HLA-presented peptidome and differentiate the immunogenic peptides is a foundation for this plethora of therapies and is in focus of ongoing research. This master thesis is a part of a project aiming to set up immunoaffinity-purification/MS based method in order to analyse the ligandome and determine T-cell recognized cancer associated antigens from tumor cells. Objectives of the work: 1. Characterizing tumor cell lines. 2. Immunological assay set up. 3. Collecting cell culture material for the ligandome affinity purification. 4. In silico prediction if the immunogenicity of selected peptides and assessing their source proteins. Methods used: 1. Cell culture. 2. FACS-analysis. 3. MTS-viability assay. 4. Immunological assays (ELISA, ELISPOT). 5. Immunological bioinformatics analysis tools (IEDB) and database search (UniPROT). Results: 1. Flow cytometric analysis provided essential information of the cell line HLA-1 expression. Additional information of PD-L1 expression can be used to evaluate cell line’s immune-evasion abilities. Preliminary MTS assay is used to determine linear range and optimal time frame for the PBMC/cancer cell co-culture killing assay. 2. Interferon γ cytokine secretion was determined by ELISPOT to assess PBMC response against known antigens in a preliminary experiment to approximate usable range for the following antigen specific PBMC assays. ELISA is used to confirm the presence of HLA-I receptors in the ligandome affinity purification eluates and to estimate the efficacy of purification. 3. Feasibility of in silico methods in the prediction of immunogenic peptides was explored. The experiments provided information that can be applied to the further development of the immune ligandome discovery project. In silico methods were successfully used to characterize previously identified HLA-restricted peptides and one previously identified immunogenic T-cell epitope. Even if the data acquired in silico can be considered only nominally verified at this stage, the results are encouraging.
Subject: immunotherapy
cancer
tumor antigen
immunopeptidome
peptidomics
antigen discovery


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
Toni Mäki Pro Gradu.pdf 1.552Mb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record